Name: 骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: 学ぶ骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離法。ネズミ筋組織からの差遠心分離とろ過を用いて高純度・高収率のSkM-EVを取得し、筋疾患の診断バイオマーカーと治療応用の基礎を築く。

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<meta charset="utf8"></head><body>研究および治療のための骨格筋由来EVの最適化された分離

<ol><li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pulsed+ultrasound+promotes+secretion+of+anti-inflammatory+extracellular+vesicles+from+skeletal+myotubes+via+elevation+of+intracellular+calcium+level%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pulsed ultrasound promotes secretion of anti-inflammatory extracellular vesicles from skeletal myotubes via elevation of intracellular calcium level.</a> Elife. 12, 89512(2023).</li>
<li>Yamaguchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+myotube-derived+extracellular+vesicles+enhance+itaconate+production+and+attenuate+inflammatory+responses+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Skeletal myotube-derived extracellular vesicles enhance itaconate production and attenuate inflammatory responses of macrophages.</a> Front Immunol. 14, 1099799(2023).</li>
<li>Takada, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+blunts+the+osteogenic+effects+of+muscle+cell-derived+extracellular+vesicles+by+affecting+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α blunts the osteogenic effects of muscle cell-derived extracellular vesicles by affecting muscle cells.</a> Calcif Tissue Int. 112 (3), 377-388 (2023).</li>
<li>Bourgeois, B. L., Levitt, D. E., Molina, P. E., Simon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+of+adipocyte+and+myotube+extracellular+vesicle+miRNA+cargo+in+chronic+binge+alcohol-administered+siv-infected+male+macaques%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol%22%5BJournal%5D)">Differential expression of adipocyte and myotube extracellular vesicle miRNA cargo in chronic binge alcohol-administered siv-infected male macaques.</a> Alcohol. 108, 1-9 (2023).</li>
<li>Kargl, C. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+potential+of+skeletal+muscle+derived+extracellular+vesicles+differs+between+oxidative+and+glycolytic+muscle+tissue+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Angiogenic potential of skeletal muscle derived extracellular vesicles differs between oxidative and glycolytic muscle tissue in mice.</a> Sci Rep. 13 (1), 18943(2023).</li>
<li>Vann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+microRNA+profiles+of+intramuscular+and+secreted+extracellular+vesicles+in+human+tissue-engineered+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Physiol%22%5BJournal%5D)">Differential microRNA profiles of intramuscular and secreted extracellular vesicles in human tissue-engineered muscle.</a> Front Physiol. 13, 937899(2022).</li>
<li>Anakor, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurotoxicity+of+vesicles+secreted+by+als+patient+myotubes+is+specific+to+exosome-like+and+not+larger+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">The neurotoxicity of vesicles secreted by als patient myotubes is specific to exosome-like and not larger subtypes.</a> Cells. 11 (5), 845(2022).</li>
<li>Mendhe, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lyophilized+extracellular+vesicles+from+adipose-derived+stem+cells+increase+muscle+reperfusion+but+degrade+muscle+structural+proteins+in+a+mouse+model+of+hindlimb+ischemia-reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Lyophilized extracellular vesicles from adipose-derived stem cells increase muscle reperfusion but degrade muscle structural proteins in a mouse model of hindlimb ischemia-reperfusion injury.</a> Cells. 12 (4), 557(2023).</li>
<li>Madison, R. D., Robinson, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-derived+extracellular+vesicles+influence+motor+neuron+regeneration+accuracy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Muscle-derived extracellular vesicles influence motor neuron regeneration accuracy.</a> Neuroscience. 419, 46-59 (2019).</li>
<li>Hanson, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EV-mediated+promotion+of+myogenic+differentiation+is+dependent+on+dose%2C+collection+medium%2C+and+isolation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">EV-mediated promotion of myogenic differentiation is dependent on dose, collection medium, and isolation method.</a> Mol Ther Nucleic Acids. 33, 511-528 (2023).</li>
<li>Frimand, Z., Das Barman, S., Kjær, T. R., Porpiglia, E., De Morrée, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+quiescent+stem+cell+populations+from+individual+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of quiescent stem cell populations from individual skeletal muscles.</a> J Vis Exp. 190, e64557(2022).</li>
<li>Théry, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+2018+%28misev2018%29%3A+A+position+statement+of+the+international+society+for+extracellular+vesicles+and+update+of+the+misev2014+guidelines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (misev2018): A position statement of the international society for extracellular vesicles and update of the misev2014 guidelines.</a> J Extracell Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).</li>
<li>Welsh, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minimal+information+for+studies+of+extracellular+vesicles+%28misev2023%29%3A+From+basic+to+advanced+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Minimal information for studies of extracellular vesicles (misev2023): From basic to advanced approaches.</a> J Extracell Vesicles. 13 (2), e12404(2024).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+proteomics+argues+against+a+general+role+for+CD9%2C+CD81+or+CD63+in+the+sorting+of+proteins+into+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Differential proteomics argues against a general role for CD9, CD81 or CD63 in the sorting of proteins into extracellular vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 12 (8), e12352(2023).</li>
<li>Baietti, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndecan-syntenin-Alix+regulates+the+biogenesis+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Syndecan-syntenin-Alix regulates the biogenesis of exosomes.</a> Nat Cell Biol. 14 (7), 677-685 (2012).</li>
<li>Shanely, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+skeletal+muscle+biopsy+procedures+using+the+modified+bergstr%C3%B6m+technique%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Human skeletal muscle biopsy procedures using the modified bergström technique.</a> J Vis Exp. (91), e51812(2014).</li>
<li>Mousavi, K., Miranda, W., Parry, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurotrophic+factors+enhance+the+survival+of+muscle+fibers+in+edl%2C+but+not+sol%2C+after+neonatal+nerve+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Neurotrophic factors enhance the survival of muscle fibers in edl, but not sol, after neonatal nerve injury.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 283 (3), C950-C959 (2002).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nat Protoc. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Ishii, K., Suzuki, N., Mabuchi, Y., Sekiya, I., Akazawa, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technical+advantage+of+recombinant+collagenase+for+isolation+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Technical advantage of recombinant collagenase for isolation of muscle stem cells.</a> Regen Ther. 7, 1-7 (2017).</li>
<li>Motohashi, N., Asakura, Y., Asakura, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+transplantation+of+muscle+satellite+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and transplantation of muscle satellite cells.</a> J Vis Exp. (86), e50846(2014).</li>
<li>Mozzetta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of muscle stem cells.</a> Methods Mol Biol. 1480, 311-322 (2016).</li>
<li>Clemens, Z., Wang, K., Ambrosio, F., Barchowsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic+disrupts+extracellular+vesicle-mediated+signaling+in+regenerating+myofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Sci%22%5BJournal%5D)">Arsenic disrupts extracellular vesicle-mediated signaling in regenerating myofibers.</a> Toxicol Sci. 195 (2), 231-245 (2023).</li>
<li>Ma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+muscle-derived+extracellular+vesicles+transport+glycolytic+enzymes+to+mediate+muscle-to-bone+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Skeletal muscle-derived extracellular vesicles transport glycolytic enzymes to mediate muscle-to-bone crosstalk.</a> Cell Metab. 35 (11), 2028-2043.e7 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.6 mL 微量遠心チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL micro tube (C)&nbsp;</td><td>エッペンドルフ</td><td>5720411009</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL 微量遠心チューブ</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3448</td><td>透明、目盛り付き、非滅菌</td></tr><tr><td>BD 5 mL シリンジ</td><td>Becton Dickinson</td><td>14-827-52&nbsp;</td><td>ルアーロックチップ</td></tr><tr><td>Cell Counting Slides, Dual Chamber for Cell Counter</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0011</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>22620667</td><td></td></tr><tr><td>洗浄液</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼII</td><td>ワージントン バイオケミカル コーポレーション</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (10x) 液体 (-カルシウム,-マグネシウム)</td><td>Cytiva</td><td>SH30378.02</td><td>最終使用希釈液は 1x</td></tr><tr><td>DPBS / 変性 (1x)</td><td>Cytiva</td><td>SH30264.02</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコの改変イーグルス培地 (DMEM)</td><td>ジェネシー サイエンティフィック</td><td>25-500</td><td></td></tr><tr><td>E-POD ピュアウォーターリモートディスペンサー</td><td>ミリポアシグマ</td><td>ZRXSP0D01</td><td></td></tr><tr><td>FA-45-30-11 微量遠心ローター</td><td>エッペンドルフ</td><td>05-401-503</td><td></td></tr><tr><td>フィッシャーボルテックス ジーニー2</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12-812</td><td></td></tr><tr><td>フロー ナノアナライザー</td><td>ナノFCM株式会社</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heratherm OGS60 一般プロトコル オーブン</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>51028112</td><td>重力対流、2.3 立方フィート 120 V</td></tr><tr><td>MemGlow-488 プローブ</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td>MG01-02</td><td></td></tr><tr><td>ミリパック スペシャル ミリポア</td><td>ミリポア シグマ</td><td>TANKMPK02</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>ギブコ</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>ピペットライト LTS ピペット L-1000XLS+</td><td>レイニン 17014382</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ピペットライト LTS ピペット L-200XLS+</td><td>レイニン</td><td>17014391</td><td></td></tr><tr><td>ピペットライト LTS ピペット L-20XLS+</td><td>レイニン</td><td>17014392</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ ER LTS 1000&micro;L F 768G/8</td><td>レイニン</td><td>30808038</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ ER LTS 20&micro;L F 960G/10</td><td>レイニン</td><td>30807966</td><td></td></tr><tr><td>ピペットチップ ER LTS 200&micro;L F 960G/10</td><td>レイニン</td><td>30807967</td><td></td></tr><tr><td>品質管理ビーズ</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>S110-AT 固定角ローター</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>45539</td><td>1,10,000 rpm</td></tr><tr><td>S16 exo 65-155nm ビーズ</td><td>NanoFCM Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>はさみ</td><td>SPI、米国</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorvall mX 150+ マイクロ超遠心機</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>50135641</td><td></td></tr><tr><td>TC 20 自動セルカウンター</td><td>Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Corning</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>ピンセット</td><td>SPI、USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VWR 15mL 遠心チューブ</td><td>アバントール</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Whatman Puradisc 13フィルターCytiva</td><td></td><td>6782-1304</td><td>0.45 &micro;m孔径</td></tr><tr><td>野生型C57BL/6Jマウス</td><td>ジャクソン研究所</td><td>ストック #000664</td><td></td></tr></tbody></table>

骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離

Enzymatic Isolation of Skeletal Muscle Interstitial Extracellular Vesicles

このプロトコルに従って、骨格筋細胞外小胞(SkM-EV)は、野生型マウスの脛骨前筋(TA)、長指伸筋(EDL)、ヒラメ筋(SOL)、腓腹筋(GAS)、および大腿四頭筋(QUA)を含むさまざまな筋肉群から成功裏に抽出されました。これらのSkM-EVのその後の特性評価は、ナノフローサイトメトリーによって行われ、表1に要約されているように、それらの明確な特徴が解明されました。驚くべきことに、わずか1gの筋肉組織から、平均粒子サイズ73.93 nm±2.70 nm、粒子サイズの中央値は72.55 nm±2.42 nmで、1.18e14±4.86e13 SkM-EVの印象的な収率が得られました。サイズ分布は13.28nm±1.71nmの分散を示し(図5)、EVの認識された定義と正確に一致しています12,13。
単離されたSkM-EVの完全性を確保するため、蛍光膜プローブであるMemG...

Extracellular vesicles (EVs) are lipid bilayer-enclosed nanoparticles released by cells to transport bioactive cargo, such as proteins, RNAs, and DNAs, ...

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

筋線維の単離および培養は、ゴールドスタンダードである...

成人骨格筋からの個々の筋線維とその衛星細胞の単離および培養

ヒト骨格筋内の血管は、再生アプリケーションに最適ですいくつかの多系列前駆体集団を保有する。内膜から筋原内皮細胞、培地から周皮細胞、および外膜から外膜細胞：この分離法は、血管の三つの構造層からそれぞれ3多能性前駆細胞集団の同時精製を可能にする。...

ヒト骨格筋からの血管由来の多能前駆体の単離

ヒトの筋肉に由来する主な接着細胞タイプは、筋原性細胞と線維芽細胞です。ここでは、CD56抗原に基づく磁気活性化細胞ソーティングを用いて細胞集団を濃縮します。その後、特異的抗体による免疫標識と画像解析技術の使用により、個々の細胞の細胞質および核特性を定量化できます。...

ヒト骨格筋からの一次筋原細胞および線維芽細胞の単離および定量的免疫組織化学的特性評価

骨格筋 (MMEC) の微小血管内皮細胞筋毛細血管の内壁の形状し、両方を規制する流体/分子と筋肉組織と血液の間 (免疫) 細胞の移行の交換。前述のように、プライマリ マウス MMEC の分離により「myovascular...

プライマリ マウス骨格筋の微小血管内皮細胞の分離

ここでは、我々 は脳、腫瘍標本を含む全体の組織から小さな細胞小胞 (Ev) を分離するための詳しいプロトコルを提供します。このメソッドでは、さらに下流解析の固体ティッシュから EVs...

全体組織からの細胞の小胞の抽出

このプロトコルは1)大人マウス腓腹筋からの第一次線維芽細胞の隔離そして文化、また2)西部のしみの分析に先行しているスクロース密度勾配と結合される差動ultrarifjugeation方法を使用してexosomesの浄化そして性格描写を示す。...

骨格筋線維芽細胞からのエクソソームの単離と特性評価

ここでは、最適化された差動超遠心法による肝癌組織由来の小さな細胞外小胞の濃縮について説明します。...

肝癌組織由来の微小細胞外小胞の濃縮法

このプロトコルは、マウスの個々の骨格筋からの筋幹細胞および線維脂肪原性前駆細胞の単離について説明しています。このプロトコルには、単一筋解剖、蛍光活性化細胞選別による幹細胞の単離、免疫蛍光染色による純度評価、および5-エチニル-2'-デオキシウリジン取り込みアッセイによるS期侵入の定量的測定が含まれます。...

個々の骨格筋からの静止幹細胞集団の分離

このプロトコルは、組織解離、逐次ろ過、プレプレート処理、定義された培養条件を通じて、成体および新生マウスの骨格筋から一次筋芽細胞を単離・濃集する標準化された方法を提供し、衛星細胞由来の筋肉芽細胞培養の確立と維持を可能にし、下流の実験応用を可能にします。...

In vitro 筋形成研究のための骨格筋サテライト細胞の単離

このプロトコルは、酸化性のヒメスから完全な単一筋繊維を分離し、これらの繊維から得られる高度に精製された筋芽細胞培養を確立することを記述しています。最適化された手法により、マウスあたり約300〜500本の完全な筋線維を確実に取得でき、下流の分子および細胞解析が可能になります。...

酸化的マイオファイバー挙動の評価のための単一線維分離アッセイ

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

学ぶ骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離法。ネズミ筋組織からの差遠心分離とろ過を用いて高純度・高収率のSkM-EVを取得し、筋疾患の診断バイオマーカーと治療応用の基礎を築く。

骨格筋間質細胞外小胞の酵素的単離

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