Name: アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 学ぶ キャベツプロトプラストシステムを用いた低酸素応答の分子メカニズム解析。酵素処理による単離法とレポーターアッセイで低酸素誘導遺伝子発現を検証し、Brassicaceaeの水没耐性向上に向けた育種基盤を構築する。

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<meta charset="utf8"></head><body>フラッディング耐性メカニズムの研究のための効率的なキャベツプロトプラストシステム

<ol><li>Tanoue, M., Hirabayashi, Y., Ikeuchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global-scale+river+flood+in+the+last+50+years%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Global-scale river flood in the last 50 years.</a> Sci Rep. 6 (1), 36021(2016).</li>
<li>Voesenek, L. aC. J., Bailey-Serres, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flood+adaptive+traits+and+processes%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Flood adaptive traits and processes: An overview.</a> New Phytol. 206 (1), 57-73 (2015).</li>
<li>Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+transduction+in+maize+and+Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Signal transduction in maize and Arabidopsis mesophyll protoplasts.</a> Plant Physiol. 127 (4), 1466-1475 (2001).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+transient+protoplast+system+for+analyzing+defense+gene+expression+and+protein-protein+interactions+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">A highly efficient transient protoplast system for analyzing defense gene expression and protein-protein interactions in rice.</a> Mol Plant Pathol. 7 (5), 417-427 (2006).</li>
<li>Yoo, S. -D., Cho, Y. -H., Sheen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+mesophyll+protoplasts%3A+A+versatile+cell+system+for+transient+gene+expression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis mesophyll protoplasts: A versatile cell system for transient gene expression analysis.</a> Nat Protoc. 2 (7), 1565-1572 (2007).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protoplast+isolation%2C+transformation%2C+and+its+application+in+sugarcane+%28Saccharum+spontaneum+L%29%5BTitle%5D)+AND+%22Crop+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of protoplast isolation, transformation, and its application in sugarcane (Saccharum spontaneum L).</a> Crop J. 9 (1), 133-142 (2021).</li>
<li>Adedeji, O. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+protocol+for+efficient+protoplast+isolation+and+transient+gene+expression+in+carnation%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">Optimization of protocol for efficient protoplast isolation and transient gene expression in carnation.</a> Sci Hortic. 299, 111057(2022).</li>
<li>Lin, H. -Y., Chen, J. -C., Fang, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protoplast+transient+expression+system+to+enable+molecular%2C+cellular%2C+and+functional+studies+in+Phalaenopsis+orchids%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">A protoplast transient expression system to enable molecular, cellular, and functional studies in Phalaenopsis orchids.</a> Front Plant Sci. 9, (2018).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+efficient+mesophyll+protoplast+isolation+and+PEG-mediated+transient+expression+system+in+eggplant%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Hortic%22%5BJournal%5D)">A highly efficient mesophyll protoplast isolation and PEG-mediated transient expression system in eggplant.</a> Sci Hortic. 304, 111303(2022).</li>
<li>Lin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+protoplast+isolation+system+for+functional+gene+expression+and+characterization+using+petals+of+Camellia+oleifera%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol+Biochem%22%5BJournal%5D)">Development of a protoplast isolation system for functional gene expression and characterization using petals of Camellia oleifera.</a> Plant Physiol Biochem. 201, 107885(2023).</li>
<li>Guo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+isolation+of+Populus+mesophyll+protoplasts+and+its+application+in+transient+expression+assays%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Highly efficient isolation of Populus mesophyll protoplasts and its application in transient expression assays.</a> PLOS One. 7 (9), e44908(2012).</li>
<li>Gottschald, O. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIAR+and+TIA-1+mRNA-binding+proteins+co-aggregate+under+conditions+of+rapid+oxygen+decline+and+extreme+hypoxia+and+suppress+the+HIF-1%CE%B1+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIAR and TIA-1 mRNA-binding proteins co-aggregate under conditions of rapid oxygen decline and extreme hypoxia and suppress the HIF-1α pathway.</a> J Mol Cell Biol. 2 (6), 345-356 (2010).</li>
<li>Cho, H. -Y., Chou, M. -Y., Ho, H. -Y., Chen, W. -C., Shih, M. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ethylene+modulates+translation+dynamics+in+Arabidopsis+under+submergence+via+GCN2+and+EIN2%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Ethylene modulates translation dynamics in Arabidopsis under submergence via GCN2 and EIN2.</a> Sci Adv. 8 (22), eadm7863(2022).</li>
<li>Boudreau, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excitation+light+dose+engineering+to+reduce+photo-bleaching+and+photo-toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Excitation light dose engineering to reduce photo-bleaching and photo-toxicity.</a> Sci Rep. 6 (1), 30892(2016).</li>
<li>Shcherbakova, D. M., Cox Cammer, N., Huisman, T. M., Verkhusha, V. V., Hodgson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+multiplex+imaging+and+optogenetics+of+Rho+GTPases+enabled+by+near-infrared+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct multiplex imaging and optogenetics of Rho GTPases enabled by near-infrared FRET.</a> Nat Chem Biol. 14 (6), 591-600 (2018).</li>
<li>Jiang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sodium+sulfite+is+a+potential+hypoxia+inducer+that+mimics+hypoxic+stress+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Inorg+Chem%22%5BJournal%5D)">Sodium sulfite is a potential hypoxia inducer that mimics hypoxic stress in Caenorhabditis elegans.</a> J Biol Inorg Chem. 16 (2), 267-274 (2011).</li>
<li>Lin, C. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SUB1A-1+anchors+a+regulatory+cascade+for+epigenetic+and+transcriptional+controls+of+submergence+tolerance+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS+Nexus%22%5BJournal%5D)">SUB1A-1 anchors a regulatory cascade for epigenetic and transcriptional controls of submergence tolerance in rice.</a> PNAS Nexus. 2 (7), pgad229(2023).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bis-molybdopterin+guanine+dinucleotide+modulates+hemolysin+expression+under+anaerobiosis+and+contributes+to+fitness+in+vivo+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Bis-molybdopterin guanine dinucleotide modulates hemolysin expression under anaerobiosis and contributes to fitness in vivo in uropathogenic Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 116 (4), 1216-1231 (2021).</li>
<li>Liu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+light+and+hypoxia-induced+gene+zmPORB1+determines+tocopherol+content+in+the+maize+kernel%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">The light and hypoxia-induced gene zmPORB1 determines tocopherol content in the maize kernel.</a> Sci China Life Sci. 67 (3), 435-448 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)</td><td>PhytoTech Labs</td><td>M825</td><td>酵素溶液調製用</td></tr><tr><td>228キャベツ種子</td><td>Takii & Co., Ltd. (京都)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>SPL ライフサイエンス</td><td>50050</td><td>酵素溶液調製用</td></tr><tr><td>6ウェル組織培養プレート</td><td>Alpha Plus</td><td>16106</td><td>プロトプラストインキュベーション用</td></tr><tr><td>70 &mu;m細胞ストレーナー</td><td>Sorfa&nbsp;</td><td>SCS701</td><td>プロトプラストろ過用</td></tr><tr><td>9cmシャーレ</td><td>Alpha Plus</td><td>16001</td><td>酵素消化用</td></tr><tr><td>嫌気性ジャー</td><td>HIMEDIA</td><td>嫌気性ジャー 3.5 L</td><td>低酸素治療用&nbsp;</td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>W5溶液調製および培養プレートコーティング用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム</td><td>J.T.Baker</td><td>131301</td><td>W5溶液およびPEG溶液調製</td></tr><tr><td>用 セルラーゼR10</td><td>ヤクルト</td><td></td><td>酵素溶液調製用</td></tr><tr><td>デシケーター</td><td>ターソン&nbsp;</td><td>402030</td><td>真空浸透用</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Bioshop</td><td>GLU501</td><td>W5溶液調製用</td></tr><tr><td>溶存酸素計</td><td>Thermo Scientific</td><td>Orion Star A223</td><td>酸素測定用</td></tr><tr><td>D-マンニトール</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1902</td><td>酵素溶液、PEG溶液、MMG溶液調製用</td></tr><tr><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム</td><td>プロメガ</td><td>E1960</td><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ</td></tr><tr><td>用 EC-オキシラーゼ</td><td>オキシラーゼ株式会社</td><td>EC-0005</td><td>低酸素治療用</td></tr><tr><td>冬鳥キャベツの種</td><td>小林タネ株式会社 (加古川市)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>高速冷蔵遠心分離機</td><td>日立</td><td>CR21GIII</td><td>プロトプラスト収穫用</td></tr><tr><td>マセロチーム R10&nbsp;</td><td>ヤクルト</td><td></td><td>酵素溶液調製</td></tr><tr><td>用 塩化マグネシウム</td><td>アルファ Aesar</td><td>12315</td><td>MMG溶液調製用</td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機</td><td>日立</td><td>CT15RE</td><td>プロトプラスト収穫用</td></tr><tr><td>マイクロプレート</td><td>グライナー</td><td>655075</td><td>デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ用</td></tr><tr><td>マイクロプレートリーダー</td><td>分子デバイス</td><td>SpectraMax Mini</td><td>用デュアルルシフェラーゼレポーターアッセイ</td></tr><tr><td>Millex 0.22 &mu;mシリンジフィルター</td><td>メルク</td><td>SLGP033RS</td><td>酵素溶液調製用</td></tr><tr><td>オイルフリー真空ポンプ</td><td>ロッカー&nbsp;</td><td>ロッカー300</td><td>真空浸透用</td></tr><tr><td>OxyFluor</td><td>Oxyrase Inc.</td><td>OF-0005</td><td>低酸素治療用</td></tr><tr><td>脱酸素パック</td><td>三菱ガス化学</td><td>AnaeroPack, MGCC1</td><td>低酸素治療用</td></tr><tr><td>酸素濃縮器</td><td>UTMOST PERFECT</td><td>AII-X</td><td>W5溶液中の酸素バブリング用</td></tr><tr><td>植物基質</td><td>Klasmann-Deilmann</td><td>Potgrond H基質</td><td>キャベツ苗調製用</td></tr><tr><td>プラスミドミディキット</td><td>QIAGEN</td><td>12145</td><td>トランスフェクショングレードのプラスミドDNAの精製&nbsp;</td></tr><tr><td>ポリエチレングリコール4000</td><td>Fluka</td><td>81240</td><td>プロトプラストトランスフェクション用</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>J.T.Baker</td><td>304001</td><td>W5溶液調製用</td></tr><tr><td>カミソリ刃</td><td>ジレット</td><td></td><td>キャベツ葉ストリップ調製用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>Bioshop</td><td>SOD002</td><td>W5溶液調製用</td></tr><tr><td>亜硫酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0505</td><td>低酸素治療用</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>Yihder</td><td>BU-240D</td><td>酵素溶液調製用</td></tr></tbody></table>

アブラナ属の低酸素耐性を研究するためのキャベツプロトプラストシステムの開発

Development of a Cabbage Protoplast System for Studying Hypoxia Tolerance in Brassica

この研究では、キャベツのプロトプラストを利用した一過性発現システムの開発に成功しました(ワークフローについては図1を参照)。プロトプラストは、セルラーゼ/マセロチーム消化と暗真空浸潤(図2B、C)を使用して、市販のキャベツ品種「ふゆどり」および「228」から適切なサイズの2〜3週齢のキャベツ本葉(図2A)から単離されました。インキュベーション中に水中のプロトプラストが経験する低酸素状態を緩和するために、酸素マシンに接続されたエアストーンバブラーを使用してW5溶液を酸素化しました(図2D)。このプロセスにより、W5溶液中の溶存酸素濃度が7.84mg·L-1 ± 0.05 mg·L-1から29.18mg·L-1 ± 0.43 mg·L-1 酸素が泡立ってから 5 分後。単離プロセス後、一晩の消化期間後のプロトプラストの収率は、「ふゆどり」で1.04 x 107、「228」で4.00 x 106 protoplasts·g-1新鮮重量でした(図2E)。その後、GFPをレポーター遺伝子としてPEG媒介トランスフェクション法の形質転換効率を評価し、キャベツのプロトプラストトランスフェクション効率が両栽培品種で40%を超えていることを示し(図2F)、このシステムの生存性を確認しました。
さらに、キャベツの嫌気性呼吸応答遺伝子である BoADH1p::Lucおよび BoSUS1Lp::Lucベクター(図3A)のプロモーターコンストラクトをレポーターとしてキャベツプロトプラストに導入し、いくつかの処理の低酸素誘導効果を評価しました。また、この一過性発現モデルシステムには、さまざまな酸素調整処理も施されました。その結果、亜硫酸ナトリウムを除くすべての酸素捕捉処理が、キャベツのプロトプラストに低酸素反応をうまく誘発することが示されました(図3B)。具体的には、 BoADH1 のプロモーター活性は、EC-OxyraseおよびOxyFluorによる処理後の対照と比較して、それぞれ約2.6倍および3.2倍に増加し、特に、脱酸素パック処理では7.0倍以上増加しました(図3B)。同様に、 BoSUS1L プロモーター活性はEC-Oxyrase処理で約1.7倍、OxyFluor処理では1.8倍に上昇し、脱酸素パック処理では5.6倍以上の大幅な増加が見られました(図3B)。これらの結果から、脱酸素パックは、このキャベツプロトプラスト実験系において、低酸素環境を作り出すのに優れた効果を発揮することが示唆された。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig01.jpg"> 
図1:プロトプラスト単離ワークフローのグラフ表示。 この図は、キャベツの葉組織からプロトプラストを単離する段階的なプロセスを示しています。ワークフローは、手順を明確に理解できるように視覚的に描かれています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig02v2.jpg"> 
図2:キャベツの葉組織からのプロトプラストの単離 (A)市販のキャベツ品種「ふゆどり」と「228」の推奨成長期の外観を示す。2葉期のキャベツの2番目に新しく完全に拡大した本葉(矢印で示されている)は、プロトプラストの分離のために選択されます。スケールバー:2cm.(B)キャベツの葉のストリップの真空浸透プロセスには真空ポンプとデシケーターが使用され、酵素消化の前に30分間の浸潤が行われます。(C)酵素消化中のキャベツの葉のストリップの状態が描かれています。葉組織の完全な消化には、合計4〜16時間が必要です。スケールバー:3cm.(D)写真は、エアストーンに接続された酸素濃縮器を使用して、W5溶液中の溶存酸素濃度を増加させていることを示しています。スケールバー:5cm.(E)「冬鳥」と「228」の両方のキャベツ品種から、新鮮重量(FW)1グラムあたり4.00 x 10を超える6 つの葉肉プロトプラストが得られ、顕微鏡で観察されました。スケールバー:200 μm. (F) 両方のキャベツ遺伝子型由来のプロトプラストのトランスフェクション効率は、構成的に発現したGFPレポーターを使用した場合、40%を超えることが示されています。スケールバー:200μmこの <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig02largev2.jpg" target="_blank">図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67444/67444fig03.jpg"> 
図3:酸素欠乏条件下でのキャベツプロトプラストの低酸素応答。 (A)低酸素応答遺伝子コンストラクトである BoADH1 および BoSUS1L プロモーターをレポーターとして利用し、キャベツプロトプラストの「ふゆどり」の低酸素応答を評価します。(B)合計5μgのレポータープラスミドを「フユドリ」キャベツプロトプラストにトランスフェクトし、酸素泡W5溶液中でインキュベートした後、低酸素処理に4時間曝露します。W5溶液にEC-オキシラーゼ(0.6単位・mL-1)、オキシフルオール(0.6単位・mL-1)、亜硫酸ナトリウム(1g・mL-1)を添加することにより、インキュベーション中の酸素レベルが低下します。脱酸素剤パックの処理は、3.5Lの嫌気性ジャーに2つの脱酸素剤バッグを入れることによって行われます。「CK」グループは、低酸素治療を行わない対照群を表しています。処理後、プロトプラストを回収し、デュアルルシフェラーゼアッセイを行います。各値は SD ±平均を表し、n = 4 です。異なる文字は、LSDの事後検定による一元配置ANOVAに基づく有意差(P &lt; 0.05)を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/67444fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表1:酵素溶液、W5溶液、MMG溶液の調製。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Table%201.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:プロトプラストトランスフェクションのプラスミドの詳細。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67444/Plasmids.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

As climate change brings more heavy rainfall, cabbage, a key Brassicaceae vegetable, faces significant yield losses due to flooding-induced hypoxia ...

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