Name: エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: 学ぶCRISPR-Cas9を用いたTHP-1細胞の遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離法。エレクトロポレーション技術でマクロファージのHIV抵抗性メカニズムを解明し、治療戦略開発に貢献する。

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<ol><li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
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<li>Tang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+high+transfection+efficiency+in+THP-1+suspension+cells+without+PMA+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A method for high transfection efficiency in THP-1 suspension cells without PMA treatment.</a> Anal Biochem. 544, 93-97 (2018).</li>
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<li>Concordet, J. P., Haeussler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPOR%3A+Intuitive+guide+selection+for+CRISPR%2FCas9+genome+editing+experiments+and+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPOR: Intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens.</a> Nucleic Acids Res. 46 (W1), W242-W245 (2018).</li>
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<li>Hrecka, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vpx+relieves+inhibition+of+HIV-1+infection+of+macrophages+mediated+by+the+SAMHD1+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Vpx relieves inhibition of HIV-1 infection of macrophages mediated by the SAMHD1 protein.</a> Nature. 474 (7353), 658-661 (2011).</li>
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<li>Batista Napotnik, T., Polajžer, T., Miklavčič, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+death+due+to+electroporation+-+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">Cell death due to electroporation - A review.</a> Bioelectrochemistry. 141, 107871(2021).</li>
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<li>Makino, S., Fukumura, R., Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illegitimate+translation+causes+unexpected+gene+expression+from+on-target+out-of-frame+alleles+created+by+CRISPR-Cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Illegitimate translation causes unexpected gene expression from on-target out-of-frame alleles created by CRISPR-Cas9.</a> Sci Rep. 6, 39608(2016).</li>
<li>Bowling, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+alternate+start+site+allows+N-terminal+nonsense+variants+to+escape+NMD+and+results+in+functional+recovery+by+readthrough+and+modulator+combination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pers+Med%22%5BJournal%5D)">Downstream alternate start site allows N-terminal nonsense variants to escape NMD and results in functional recovery by readthrough and modulator combination.</a> J Pers Med. 12 (9), 1448(2022).</li>
<li>Inácios, Â, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonsense+mutations+in+close+proximity+to+the+initiation+codon+fail+to+trigger+full+nonsense-mediated+mRNA+decay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Nonsense mutations in close proximity to the initiation codon fail to trigger full nonsense-mediated mRNA decay.</a> J Biol Chem. 279 (31), 32170-32180 (2004).</li>
<li>Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inversions+and+duplications+of+mammalian+regulatory+DNA+elements+and+gene+clusters+by+CRISPR%2FCas9%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Efficient inversions and duplications of mammalian regulatory DNA elements and gene clusters by CRISPR/Cas9.</a> J Mol Cell Biol. 7 (4), 284-298 (2015).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR+inversion+of+CTCF+sites+alters+genome+topology+and+enhancer%2Fpromoter+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR inversion of CTCF sites alters genome topology and enhancer/promoter function.</a> Cell. 162 (4), 900-910 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.2 &マイクロ;m シリンジフィルター</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td>_</td></tr><tr><td>0.4 % トリパンブルー</td><td>ベックマンコールター</td><td>383200</td><td>_</td></tr><tr><td>1.5 mL チューブ</td><td>エッペンドルフ</td><td>3810X</td><td>_</td></tr><tr><td>24-ウェルプレート</td><td>コーニング</td><td>353047</td><td>_</td></tr><tr><td>6x TriTrack DNA ローディング色素</td><td>サーモサイエンティフィック</td><td>R1161</td><td>_</td></tr><tr><td>75 cm&sup2;培養フラスコ ベントキャップ</td><td>コーニング</td><td>353136</td><td>_</td></tr><tr><td>8-ストリップPCRチューブ キャップ付き</td><td>ライフテクノロジー</td><td></td> <td>AM12230_</td></tr><tr><td>96ウェルプレート 平底</td><td>コーニング</td><td></td> <td>353072_</td></tr><tr><td>96ウェルプレート 丸底</td><td>コーニング</td><td>353077</td><td>_</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5</td><td>_</td></tr><tr><td>ATGpr</td><td>_</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>https://atgpr.dbcls.jp/ ChemiDoc イメージングシステム</td><td>BIO-RAD</td><td>12003153</td><td>_</td></tr><tr><td>Counting slide</td><td>NanoEntek</td><td>DHC-N04</td><td>_</td></tr><tr><td>CRISPOR</td><td>_</td><td>_</td><td>http://crispor.gi.ucsc.edu/</td></tr> <tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td></td> <td>14190094_</td></tr><tr><td>Ensembl</td><td>EMBL-EBI</td><td>_</td><td>https://www.ensembl.org/index.html</td></tr><tr><td>Fetal BovineSerum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>_</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>BD Life Sciences</td><td>v10.10</td><td>_</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder</td><td>Thermo scientific</td><td>SM0323</td><td>_</td></tr><tr><td>Genome Data Viewer</td><td>NCBI</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gdv/ GraphPad Prism</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 9.3.1</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA ポリメラーゼ</td><td>Agilent</td><td></td> <td>600679_</td></tr><tr><td>ICE CRISPR分析ツール</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>https://www.synthego.com/products/bioinformatics/crispr-analysis</td></tr><tr><td>Image Lab</td><td>Touch BIO-RAD</td><td>_</td><td>Version 2.4.0.03</td></tr><tr><td>NEBuffer 2</td><td>New England Biolabs</td><td>B7002S</td><td>T7EI M0302S</td></tr><tr><td>Neon Kit, 10 & micro;L</td><td>Invitrogen</td><td>MPK1025K</td><td>エレクトロポレーションキット チップ、チューブ、バッファー R および E</td></tr><tr><td>ネオントランスフェクションシステム</td><td>Invitrogen</td><td>MPK5000</td><td>_</td></tr><tr><td>NetStart 1.0</td><td>_</td><td></td><td>https://services.healthtech.dtu.dk/services/NetStart-1.0/</td></tr> <tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Synthego</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>_PCR プライマー (EGFP)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>FW : GGAATGCAAGGTCTGTTGAATG ;改訂 : CACCTTGATGCCGTTCTTCT</td></tr><tr><td>PCR プライマー (SAMHD1)</td><td>Eurofins</td><td>_</td><td>Fw : CGGGATTGATTTGAGGACGA ;改訂 : GGGTGGCAAGTTAGTGAAGA</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン (10,000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td></td> <td>15140122_</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15714</td><td>_</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>_</td></tr><tr><td>PrimerQuest</td><td>IDT</td><td>_</td><td>https://eu.idtdna.com/pages/tools/primerquest</td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>_</td></tr><tr><td>QuickExtract DNA 抽出ソリューション</td><td>Biosearch Technologies</td><td>QE09050</td><td>_</td></tr><tr><td>RPMI 1640, GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>61870010</td><td>_</td></tr><tr><td>SnapGene Viewer</td><td>Dotmatics</td><td>_</td><td>Version 7</td></tr><tr><td>SpCas9 2NLS Nuclease</td><td>Synthego</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>_SYBR Safe DNA Gel Stain Invitrogen</td><td></td><td>S33102</td><td>_</td></tr><tr><td>Synthetic sgRNA (EGFP)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : CGCGCCGAGGUGAGUUCGA ; #2 : UUCAAGUCCGCCAUGCCCGA ; #3 : CAACUACAAGACCCGCGCGCCG</td></tr><tr><td>合成 sgRNA (SAMHD1)</td><td>Synthego</td><td>_</td><td>#1 : AUCGCAACGGGGACGCUUGG ; #2 : GCAGUCAAGAACCUCGGCGC ; #3 : CCAUCCCGACUACAAGACAU</td></tr><tr><td>シリンジ Plastipak ルアーロック</td><td>BD</td><td>301229</td><td>_</td></tr><tr><td>T100 サーマルサイクラー</td><td>BIO-RAD</td><td>1861096</td><td>_</td></tr><tr><td>T7 エンドヌクレアーゼ I</td><td>NewEngland Biolabs</td><td>M0302S</td><td>_</td></tr><tr><td>TAE buffer UltraPure、10x</td><td>Invitrogen</td><td>の 15558026</td><td>400 mM トリス酢酸、10 mM EDTA</td></tr><tr><td>THP-1 細胞</td><td>ATCC</td><td>TIB-202</td><td>_</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05 %)</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td>_</td></tr><tr><td>ZE5 Cell Analyzer</td><td>BIO-RAD</td><td>12014135</td><td>_</td></tr></tbody></table>

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このビデオでは、CRISPR-Cas9技術を用いてヒトT細胞の遺伝子編集を行うアッセイを実演しています。初代CD4+およびCD8+...

T細胞の遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9技術

ここで説明したジェノタイピング技術、キャピラリーゲル電気泳動に結合する蛍光ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、ヌクレアーゼ媒介ノックアウトクローンのハイスループット遺伝子型決定を可能にします。これは、他の遺伝子型判定技術が直面している制限を回避し、配列決定法よりも費用対効果の高いです。...

ハイスループットフォーマットでの遺伝子型CRISPR / Cas9媒介ノックアウト変異体に蛍光PCR-キャピラリーゲル電気泳動法を用いました

体細胞株を遺伝子操作する能力の最近の進歩は、基礎研究および応用研究の大きな可能性を秘めている。ここでは、選択マーカーを使用した場合と使用しない場合の、哺乳類細胞株におけるCRISP / Cas9生成ノックアウト産生およびスクリーニングのための2つのアプローチを提示する。...

哺乳類細胞におけるCRISPR / Cas9媒介遺伝子ノックアウトの選択依存性および独立した世代

これは修正の CRISPR/Cas9 ribonucleoproteins を用いた編集が続いてプロトコル記述フィーダー無料条件で人間の膵臓の細胞からフット プリント無料誘導多能性幹細胞 (Ips)...

効率的な生成および CRISPR Cas9 システムを用いた人間の膵臓細胞から Ips をフィーダー フリーの編集

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

ここでは、 Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/結合) を使用してプライマリまたは拡張された人間の自然なキラー (NK) 細胞を遺伝的に変更するためのプロトコルを提案する.このプロトコルを使用して、我々 はヒト NK 細胞 (TGFBR2) -b の成長因子受容体 2 の変換のし、ヒポキサンチン phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1)...

Cas9 Ribonucleoproteins を使用してノックアウト プライマリおよび拡張された人間の NK 細胞の生成

ここに提示される、チューブエレクトロポレーションを用いて哺乳動物細胞における効率的なCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介遺伝子編集のためのプロトコルである。...

CRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質媒介精密遺伝子編集チューブエレクトロポレーション

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

ここでは、遺伝子型と表現型の依存関係を調査し、神経膠芽腫治療の可能性のある薬剤をスクリーニングするために、実験室で操作された神経膠芽腫オルガノイド(LEGO)を生成および利用するための包括的なプロトコルについて概説します。...

実験室で設計された膠芽腫オルガノイド培養および薬物スクリーニング

CRISPR/Cas9技術を使用して、相同性終末結合(HMEJ)DNA修復経路 を介して...

大規模DNAテンプレートの相同性を介した末端結合標的統合 による 初代ヒトT細胞の非ウイルス工学

学ぶCRISPR-Cas9を用いたTHP-1細胞の遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離法。エレクトロポレーション技術でマクロファージのHIV抵抗性メカニズムを解明し、治療戦略開発に貢献する。

エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

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