エレクトロポレーションに基づくTHP-1細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子ノックアウトとシングルセルクローン単離

私の研究活動は、マクロファージがエイズパンデミックの原因ウイルスであるHIVの感染に抵抗性を持つようになるメカニズムを理解することに焦点を当てています。特に、ウイルスゲノムの構成要素であるNTPを分解するHT-1と呼ばれる酵素の活性に着目しています。しかし、この酵素には、私たちが解明しようとしている他の活性もあります。

私たちは、THP1細胞を遺伝子操作するためのプロトコルを確立しました。これらの細胞は、ヒトマクロファージが研究するための十分に確立された代理です。たとえば、HIV-1の複製。

これらの細胞は、タンパク質含有量を操作するためにトランスフェクションすることが困難です。そこで、CRISPR-Cas9技術を用いて彼らのゲノムを操作する方法を確立します。SG RNAの設計から、ポリクローナルおよびモノクローナル集団の検証まで。

私たちのプロトコルは、Cas9ヌクレアーゼエネルギーRNAによって作られた組み立て済みのリボ核タンパク質複合体でエレクトロポレーションされるTHP1細胞の目的の遺伝子の高効率編集を達成することを目的としています。このアプローチでは、Cas9の活性は時間に制限されています。これにより、レンチベクターの使用時によく発生する標的効果が発生する可能性が低くなります。

そしてこの場合、Cas9の発現は時間を延長しているため、細胞に損傷を与える可能性があります。まず、24ウェル培養プレートの各ウェルに、抗生物質を含まない500マイクロリットルのRPMI 1640培地を充填し、20%の熱で不活化およびろ過されたFBSを補充します。プレートを加湿インキュベーターに一晩置きます。

乾燥したシングルガイドまたはsgRNAを最終濃度100マイクロモルまで再水和するには、sgRNA1ナノモルあたり10マイクロリットルのTEバッファーを追加します。溶液を30秒間ボルテックスし、摂氏4度で一晩インキュベートして、完全な水分補給を確保します。翌日、30マイクロモルの作業用sgRNA溶液を調製するために、まず100マイクロモルのストックsgRNA溶液をピペットで短時間ホモジナイズし、次に茎をヌクレアーゼフリー水で希釈します。

溶液を30秒間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。3つの、30マイクロモルのsgRNAのワーキング溶液と0.5マイクロリットルの20マイクロモルCas9溶液のそれぞれを1マイクロリットルの再懸濁緩衝液Rで希釈し、Cas9 sgRNAリボ核タンパク質を組み立てるために、1〜9モル比を追加します。短時間ボルテックスし、室温で5分間インキュベートします。

未編集のコントロールを調製するには、0.5マイクロリットルの20マイクロモルCas9溶液を6.5マイクロリットルの再懸濁バッファーR.Vortexに短時間加え、室温で5分間インキュベートし、5マイクロリットルの再懸濁バッファーRをサンプルに加えて、エレクトロポレーション条件ごとに12マイクロリットルの最終容量を達成します。細胞計数後にTHP-1細胞を調製するには、THP-1細胞の6倍分の10の0.2倍に相当する容量を回収し、336Gで摂氏20度で5分間遠心分離し、ピペットで上清を吸引し、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。再度遠心分離し、細胞ペレットを12マイクロリットルのリボ核タンパク質溶液に再懸濁します。

エレクトロポレーションシステムを設定するには、ピペットステーションをバイオセーフティキャビネットの下に置き、キャビネット内にエレクトロポレーションチューブを配置し、エレクトロポレーションキットから3ミリリットルのバッファーEをエレクトロポレーションチューブに追加します。エレクトロポレーションデバイスの電源を入れ、タッチスクリーンを使用してエレクトロポレーションパラメータ、電圧を1、500ボルトに設定します。duration を 10 ミリ秒に設定します。

そして、3つに数えます。エレクトロポレーションピペットにチップを装備し、10マイクロリットルのリボ核タンパク質THP-1溶液を吸引します。ピペットをエレクトロポレーションチューブに挿入し、エレクトロポレーションデバイス画面のスタートを押します。

メッセージが表示されるのを待ち、ピペットをチューブから取り外します。THP-1細胞を予熱した24ウェル培養プレートのウェルに移し、サンプルを穏やかに均質化します。プレートを加湿インキュベーターに戻し、細胞を72時間邪魔されずに休ませます。

エレクトロポレーションおよびセルカウント後、6個のTHP-1セルの累乗に10の0.1倍に相当する容量を1.5ミリリットルのチューブに引き込みます。細胞を336Gで摂氏20度で5分間遠心分離し、上清を吸引してから、ペレットを500マイクロリットルのPBSに再懸濁します。再度、細胞を遠心分離し、ペレットを乱さずにできるだけ多くの上清を吸引してスナップし、ペレットを凍結します。

ゲノムDNAの抽出のために、ペレットを50マイクロリットルのDNA抽出溶液で再懸濁する。それを均質化し、全容積を0.2ミリリットルのPCRチューブに移します。チューブをボルテックスし、3秒間のパルスで短時間遠心分離します。

チューブをサーマルサイクラーに入れ、摂氏65度で15分間、続いて摂氏98度で10分間加熱します。次に、抽出したDNAを90マイクロリットルの超純水で希釈し、ボルテックスし、5000Gで3秒間短時間遠心分離します。PCRプライマーを超純水で最終濃度10マイクロモルに希釈します。

0.2ミリリットルのPCRチューブでPCRミックスを調製します。PCRチューブをサーマルサイクラーにセットし、指定された設定でプログラムを実行します。新しい0.2ミリリットルチューブ内のポリクローナル編集集団用。

17.5マイクロリットルのPCRアンプリコンと2マイクロリットルのEバッファー2を混合して、最終容量を19.5マイクロリットルにします。溶液をボルテックスし、または、単一細胞クローンをスクリーニングするために、短時間遠心分離し、編集されたコントロール細胞と編集されていないコントロール細胞のPCR産物を1対1の比率で混合します。ヘテロデュプレックス形成の場合は、チューブをサーマルサイクラーに入れ、所定のプログラムを実行します。

ヘテロ二本鎖形成後、0.5マイクロリットルのTセブンエンドヌクレアーゼ1溶液をチューブに加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。ゲル電気泳動用のサンプルを調製するには、5マイクロリットルのT7エンドヌクレアーゼ1消化産物または未消化PCR産物を5マイクロリットルの水および2マイクロリットルの6xDNAローディング色素と混合し、サンプルとサイズラダーをゲルにロードし、ゲルを80ボルトで45分間泳動します。CRISPR Cas9を介したEGFP遺伝子座の遺伝子編集により、GFP陽性細胞が急激に減少し、エレクトロポレーション後7日目までに90%以上減少しました。

エレクトロポレーション後3日目までに、エレクトロポレーションによるストレスにより細胞数は半減していましたが、完全なRPMI培地では7日目までに完全に回復しました。T7エンドヌクレアーゼとアガロースのゲル電気泳動により、編集細胞内の約75塩基対フラグメントが失われ、EGFP標的部位のCRISPR編集が確認されました。