Name: 重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: 学ぶ iPSC由来軟骨細胞スフェロイド作製法。低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いて、安定した3D培養系を構築し、慢性関節疾患の軟骨修復治療に応用する手法を解説します。

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この研究は、LOPUKHIN FRCC PCM の倫理委員会によってレビューされ、承認されました (プロトコル番号 2019/02 2019 年 4 月 9 日)。すべてのドナーサンプルは、ヘルシンキ宣言の原則に従って取得されました。インフォームド コンセントは、すべての参加者および/またはその法定後見人から得られました。
注:プロトコル全体を通して滅菌技術を維持します。すべての培地と溶液を37°Cに温めてから、細胞またはスフェロイドに適用してください。37°CのCO2 インキュベーターで、湿度80%に対して5%のCO2 で細胞を培養します。プロトコル スキームを 図 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67481/67481fig1.jpg"> 
図1:iPS細胞株から軟骨球を作製するためのプロトコール IPSRG4S. (A) 最初に、iPS細胞は多能性幹細胞培地で80%のコンフルエント度に達するまで培養されます。(B)軟骨細胞系譜への分化を誘導するために、iPS細胞を培地Aで2日間培養します。その後、培地をChir 99021およびRhoキナーゼ阻害剤を欠損した製剤に交換し、細胞をさらに6日間培養し、2日ごとに培地を交換します。(C)次に、細胞を培地Bに移し、次の10日間、軟骨形成を促進します。(D)十分な細胞数が得られると、プロセスはスフェロイド産生段階に進みます。(E)細胞は、重力下で低接着状態でスフェロイドに凝集します。(F)得られたスフェロイドは、媒体Bのミニバイオリアクターで培養されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67481/67481fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>
1. シャーレのミニバイオリアクターへの変換
注:詳細は前の記事5を参照してください。
<ol>
	<li>滅菌オートクレーブハサミを使用して、遠心分離チューブを高さ7〜8mmのリングにスライスします(オートクレーブ設定:15psiで121°C(250°F)、30分、オートクレーブ乾燥後20分)。</li>
	<li>接着力の低い、未処理の、または微生物学的なシャーレを細かく砕きます。約1gのプラスチック粒子を10mLのクロロホルムに一晩溶かし、液体プラスチック溶液を作ります。この手順はドラフトで行ってください。</li>
	<li>液体プラスチックがピペッティングに十分な粘性があることを確認します。液滴が表面に広がるのではなく、球形を維持していることを確認します。溶液が薄すぎる場合は、通常1〜3g必要なプラスチック粒子を追加します。濃すぎる場合は、クロロホルムを追加で追加し、通常は最大5mL必要とします。</li>
	<li>以下に概説する2つの効果的な方法のいずれかを使用して、滅菌済みの超低接着60mmペトリ皿の中央にプラスチックノブを形成します。<ol>
		<li>オプション1:オートクレーブ処理されたプラスチックリングをペトリ皿の中央に置き、リングの内側に液体プラスチックを塗布します。1滴には、約100〜200μLの液体プラスチックが必要です。</li>
		<li>オプション2:プラスチックリングを使用せずに、同じ数の液体プラスチックをペトリ皿の中央に直接塗布します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>皿を蓋をせずに、層流フードで2〜3時間乾かします。乾燥後、皿を紫外線に20〜30分間さらします。</li>
</ol>
2.ゼラチンによる培養皿の処理
<ol>
	<li>粉末ゼラチンを蒸留水95°Cに溶解して、0.1%ゼラチン溶液を調製します。 溶液を0.45 μmおよび0.25 μmのメンブレンフィルターに順次通し、濾液を4°Cで保存します。</li>
	<li>軟骨細胞の再播種直前に、3mLのゼラチン溶液を25cm2 フラスコに塗布します(T25フラスコあたり最大15gの軟骨組織が推奨されます)。室温(RT)で30分間インキュベートし、ゼラチンを除去し、PBSで2回すすぎ、細胞播種を進めます。</li>
</ol>
3. 軟骨細胞の単離と培養
注:軟骨細胞は、人工膝関節全置換術を受けている患者の非体重負荷軟骨領域から分離されます。すべての検体を滅菌条件下で採取し、200 U/mL ペニシリン/ストレプトマイシン溶液を含む DMEM を充填した滅菌チューブに保管します。軟骨ティッシュは2〜8°Cの冷蔵庫で保存してください。
<ol>
	<li>軟骨採取後2日以内に酵素治療を開始してください。60mmのシャーレを使用してハンクス溶液で軟骨片を洗浄し、オートクレーブはさみを使用して軟骨を直径約1〜2mmの断片に切断します。</li>
	<li>軟骨片を15mLチューブに移し、DMEM中の0.01%コラゲナーゼII型溶液(軟骨1gあたり約1mL)で、37°C、5%CO2、湿度100%に設定されたCO2インキュベーターで、150〜200rpmのオービタルシェーカーで連続的に攪拌しながら、8〜12時間以内に消化します。</li>
	<li>消化後、15 mLチューブにDMEMを加えて軟骨断片を洗浄し、300 × g で10分間遠心分離します。断片を軟骨細胞培養培地(補足表1)に再懸濁し、0.1%ゼラチン溶液でプレコートした接着剤T25フラスコに播種します。</li>
	<li>80%のコンフルエント密度が達成されたときの軟骨細胞の継代。<ol>
		<li>継代では、軟骨細胞をハンクス溶液で洗浄し、0.25%トリプシン溶液で細胞を37°Cで5分間インキュベートします。</li>
		<li></li><li></li></ol></li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li></ol><ol><li></li><li></li><li><li> </li><li> </li></ol><ol><li></li><li></li><li></li><li></li><li> </li><li></li><li></ol>

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25300-062</td><td></td></tr><tr><td>0.25% トリプシン溶液</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>アドバンスド DMEM/F12 イーグルス培地</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>12634028</td><td></td></tr><tr><td>アグリカンモノクローナル抗体</td><td>Invitrogen</td><td>AHP0022</td><td>宿主:マウス;希釈:1/500</td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td></td><td>ΣA4544</td><td>50 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>17504044</td><td>1x または 2%</td></tr><tr><td>β-メルカプトエタノール</td><td>Serva</td><td>28625</td><td>90 mM</td></tr><tr><td>BMP2</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-110-922</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td>Chir 99021</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-926</td><td>10 &mu;M</td></tr><tr><td>COL1A1 (E6A8E) モノクローナル抗体</td><td>CellSignalling</td><td>39952</td><td>宿主:ウサギ;希釈:1/800</td></tr><tr><td>COL2A1(M2139)モノクローナル抗体</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-52658</td><td>宿主:マウス;希釈:1/50</td></tr><tr><td>コラゲナーゼII型溶液&nbsp;</td><td>PanEco</td><td>P011-2</td><td>0.01%</td></tr><tr><td>DAPI(4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-5MG</td><td>1 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>DMEM 培地 グルタミンなし</td><td>PanEco</td><td>?420?</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>10270106</td><td>10%</td></tr><tr><td>ハンクスのソリューション&nbsp;</td><td>パネコ</td><td>020?</td><td></td></tr><tr><td>Hybris 8 medium</td><td>PanEco</td><td>?780?/?780</td><td></td></tr><tr><td>Insulin-Transferrin-Selenium solution</td><td>PanEco</td><td>?065</td><td>1x 溶液の濃度は次のとおりです。g/mL;トランスフェリン:5.5 & マイクロ;g/mL;セレン5 ng / mL</td></tr><tr><td>L-アラニル-L-グルタミン&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050038</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>マトリゲル基底膜マトリックス</td><td>BD</td><td>354277</td><td>300 &mu;g/mL</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン溶液</td><td>PanEco</td><td>?063?</td><td>100 U/mL</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-117-339</td><td>10 nM</td></tr><tr><td>Rho キナーゼ阻害剤 Y27632</td><td>Miltenyi biotec</td><td>130-103-922&nbsp;</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>二次抗体ヤギ抗マウスIgG(H + L)交差吸着、Alexa Fluor 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>A21422</td><td>ホスト:ヤギ;希釈:1/500</td></tr><tr><td>二次抗体ヤギ抗ウサギIgG(H + L)高交差吸着、Alexa Fluor Plus 555</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>?32732</td><td>ホスト: ヤギ;希釈率:1/500</td></tr><tr><td>Sox9 (D8G8H) モノクローナル抗体</td><td>CellSignalling</td><td>82630</td><td>宿主:Rb;希釈:1/400</td></tr><tr><td>TeSR-1中型</td><td>STEMCELL</td><td>テクノロジー85850</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&β;1&nbsp;</td><td>ミルテニーバイオテック</td><td>130-095-067</td><td>10 ng / mL</td></tr></tbody></table>

重力下での低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いた種々の軟骨細胞からのスフェロイド作製

Generating Spheroids from Various Chondrocytes using Low-Adhesive Conditions under Gravity and Homemade Mini-Bioreactors

概説されたプロトコルを 図 1 に示します。この方法論では、2つの異なる培地を使用して、iPS細胞の軟骨細胞スフェロイドへの分化を最短1か月で推進します(図2)。分化プロセスは、iPS細胞が75%〜90%のコンフルエンシーを達成したときに開始されます(図1B)。軟骨形成分化の初期の指標は、培地Aでの培養の9〜10日目頃に現れ、細胞が軟骨細胞に特徴的な形態を採用することによって特徴付けられます。10日目に、細胞を培地B(図1C)に移し、19日目までに分化が完了するまで培養します(図3)。この段階では、99%の細胞が軟骨形成マーカー(アグリカン(ACAN)、I型コラーゲン(COL1A2)、II型コラーゲン(COL2A1)、SOX9)に陽性であり、多能性細胞マーカーTRA-1-81お...

Cartilage repair in chronic joint diseases demands advanced cell-based therapies to regenerate damaged tissues effectively. This protocol provides a ...

generating-spheroids-from-various-chondrocytes-using-low-adhesive

Research

JoVE Journal

Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

滑液の高濃度の培養ヒト関節軟骨細胞の3次元システムについて説明する。滑液は関節軟骨のための最も自然な微小環境を反映し、容易に入手し、保存することができます。このシステムは、このように軟骨再生の研究や、関節炎を治療するための治療薬をスクリーニングするために使用することができます。...

滑液における培養ヒト関節軟骨細胞用の3Dシステム

軟骨細胞による軟骨細胞外基質の生合成は、機械的刺激を印加することによって影響を受けることができます。このメソッドは、3Dコンストラクトおよび軟骨代謝の誘導された変化の評価にカプセル化された軟骨細胞への動的圧縮歪みを適用する方法について説明します。...

軟骨アガロースゲルの機械的刺激

軟骨修復は満たされていない医学的課題であり、ヒトの関節軟骨を操作するための細胞ベースのアプローチは有望な解決策です。ここでは、ヒト関節軟骨細胞の拡大と成熟のための理想的なツールとして、3次元(3D)生体模倣ハイドロゲルについて説明します。...

関節軟骨細胞培養軟骨の生成のための3Dハイドロゲルの足場

機械的ストレスは幹細胞の軟骨分化を誘発し、損傷した軟骨の修復のための潜在的な治療アプローチを提供します。遠心重力(CG)を使用して脂肪由来幹細胞(ASC)の軟骨形成分化を誘導するプロトコルを提示します。CGによるSOX9のアップレギュレーションは、軟骨原性表現型の発症をもたらします。...

遠心重力によって脂肪由来幹細胞の軟骨形成分化誘導

この記事では、軟骨細胞圧縮のための空気作動性マイクロ流体デバイスを製造し、特徴付けるための詳細な方法を提供します。...

動的圧縮で軟性細胞を刺激するマイクロ流体プラットフォーム

細胞回転楕円体を培養できるモータ駆動遠心マイクロ流体装置を紹介する。この装置を使用して、単一または複数の細胞タイプの回転楕円体は、高い重力条件下で容易に共培養することができる。...

多細胞三次元回転楕円体を生成するためのラボオンCDプラットフォーム

ここでは、自動ピペッティングシステムを使用して細胞懸濁液を播種し、スフェロイドのサイズと形状の均質性を確保する脂肪由来間質/幹細胞(ASC)スフェロイドの大規模生産について説明します。これらのASCスフェロイドは、3Dバイオプリンティングアプローチのビルディングブロックとして使用できます。...

3Dバイオプリンティングのための脂肪由来幹細胞スフェロイドの大規模自動生産

本プロトコルは、3Dプリントされたスタンプ様デバイスを使用して、大規模かつ費用対効果の高い方法で組織スフェロイドを作製する技術を記載している。...

3Dプリントされたスタンプ状デバイス による 組織スフェロイドの生成

このプロトコルでは、軟骨細胞、フィブロネクチン接着アッセイ由来軟骨形成因子(FAA-CP)、およびヒト関節軟骨からの移動性軟骨形成因子(MCP)の単離について詳しく説明します。酵素消化、フィブロネクチン接着、およびこれらの細胞を単離および特性評価するための遊走ベースのアッセイをカバーしています。...

フィブロネクチン接着および回遊アッセイを用いた軟骨細胞および軟骨形成細胞の単離

この研究では、アガロース型にマイクロウェルを作製するためのスタンプベースのシステムを使用して、3D細胞構造を生成するための費用対効果が高く効率的な方法論を提示します。このシステムは、均一なスフェロイド/オルガノイドの形成を促進し、細胞相互作用を改善します。このアプローチは、実験のばらつきを減らし、薬物試験や組織工学への応用をサポートします。...

新規スタンプデバイスを用いた二次元細胞培養からの三次元スフェロイド/オルガノイドの作製

学ぶ iPSC由来軟骨細胞スフェロイド作製法。低接着条件と自家製ミニバイオリアクターを用いて、安定した3D培養系を構築し、慢性関節疾患の軟骨修復治療に応用する手法を解説します。

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