Name: 成人の ショウジョウバエ の外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-08T14:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ 低コストで高解像度のイメージングプロトコルを用いて、成人Drosophilaの眼の成長とパターニング欠陥を定量化する方法。がん進行に関連する細胞内pH動態の影響をin vivoで評価する実用的ツールです。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1.成虫の ショウジョウバエ の収集と固定
<ol>
	<li>ショウジョウバエのクロスを設定するか、菌株を選択してフライフードの入ったバイアルに入れます。バエが成長し、成虫が閉じるまで(25°Cで~10~14日)、所望の温度(通常は25°C)でバイアルをインキュベートします。</li>
	<li>ハエをCO2 で麻酔し、CO2 パッドの上に置きます。</li>
	<li>羽でハエを選別し、目的の表現型(例:まっすぐな翼)を持つ個体を選択します。1 mLの血清ピペットの先細りの端に収まるようにガチョウの羽をトリミングして、フェザーフライソーターを作成します。</li>
	<li>1.7 mLの微量遠心チューブに1 mLの70%エタノールを調製します。選択したハエを微量遠心チューブに入れ、氷の上に置きます。微量遠心チューブは4°Cで一晩保管してください(図2A)。 注:ハエをエタノールで24時間以上保存しないでください。70%エタノールでハエを長期間保存すると、目と体の色素が失われます。</li>
</ol>
2. ポイントマウントによるサンプル調製
注: ショウジョウバエ は柔らかい体の昆虫で、風乾するともろくなり、崩壊します。したがって、このプロトコルでは、サンプルをマウントしたその日にイメージングする必要があります。一度に~5匹のフライの小さなセットで作業し、サンプルの損失を防ぎます。効率に基づいてセット内のサンプル数を増やします。イメージングまでにより多くの時間を必要とする標本は、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)の濃度を上げることにより脱水することができます14。
<ol>
	<li>専用のポイントパンチを使用して、アーカイブの65ポンドの厚紙から小さな三角形のポイント(7.1 mm x 2.7 mm)を切り取ります。Dumont #5 細先端鉗子を使用して、先端 (最も狭い 25%) を 90° の角度に曲げてポイントを準備します (図 2B)。</li>
	<li>Dumont #5細い先端の鉗子を使用して、ハエを微量遠心チューブから取り出します(ステップ1.4)。糸くずの出ない実験用ティッシュでハエをやさしく吸い取り、余分なエタノールを取り除きます。各フライをインデックスカードの左側に、解剖顕微鏡で配置します。 注:関心のある領域ではない解剖学的構造を保持して、チューブからハエを取り除きます-頭をイメージングするときは、翼または脚でサンプルを保持します。腹部にサンプルを保持しないでください、その構造はフライをカードポイントに接着するために使用されます。</li>
	<li>皮のりを準備し、その一貫性を希望の粘度に調整します。1〜2滴の皮接着剤を1〜2滴の脱イオン(DI)水と混合し、インデックスカード上のトランスファーピペットと混合します。鉗子で幅の広い端に準備されたカードポイントを拾い上げ、接着剤と水の混合物に軽くたたいて、ポイントの曲がった先端に希釈した接着剤を少量置きます(図2C)。 注:接着剤は広げられる必要がありますが、水っぽくはありません。</li>
	<li>ポイントの曲がった先端を腹部セグメント2-3の周りの右腹部の前方に当てます(図2C)。接着剤が乾く前に、フライの前後軸がポイントの曲がった先端に垂直になるようにフライをわずかに調整します。</li>
	<li>No.3の取り付けピンをカードポイントの広い方の端(図2D)に挿入し、昆虫ピン留めブロック(図2E)に固定します。各ピンまたはピンの行に対応する遺伝子型にラベルを付けます。</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig02.jpg"> 
図2:サンプル調製 (A)成体の ショウジョウバエ は、表現型マーカーに基づいて選別され、氷上に70%エタノールを含む標識された微量遠心チューブに収集されます。ハエは4°Cで一晩保管されます。(B)紙のカードポイントは、#5鉗子のペアを使用して、狭い方の端をカードの残りの部分から90°曲げることによって準備されます。(C)ハエをチューブから回収し、短時間風乾させます。皮のりは、準備されたカードポイントの小さな折り畳まれた端に塗布され、腹部セグメント2-3で成虫のハエに接着されます。(D)標本は、識別ラベル付きで、#3ステンレス鋼の昆虫ピンに取り付けられます。(E)ピン留めされた標本は、画像取得の準備が整うまでサンプルボードに保存されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
3. 高解像度フォーカススタッキングイメージング取得
<ol>
	<li>組み立てられカスタマイズされたフォーカススタッキングイメージングシステムを使用して、フライアイの高解像度写真を取得します。<ol>
		<li>70-200 mm望遠レンズを77 mmレンズアダプターを介して20x Apo顕微鏡対物レンズに接続されたデジタル一眼レフカメラボディで写真を撮影します。</li>
		<li>試料がディフューザーを介してフラッシュで照らされていることを確認します(図3)。</li>
		<li>スタックショットコントローラーとマクロレールを使用してZ位置を制御します。</li>
		<li>カメラ、フラッシュ、電動ステージを頑丈な陽極酸化アルミニウム三脚に接続します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ポイントマウントされた各サンプルをユニバーサルステージジンバルに配置し、目がレンズの方を向くようにヘッドを向けます。鉗子で頭をそっと動かして、頭の位置を調整します。 注意: 大規模で迅速な調整は、誤って斬首される可能性があります。</li>
	<li>カメラをラップトップコンピューターにテザリングした状態で、ソフトウェアで撮影設定を調整します。倍率20倍で試料を撮影するには、フラッシュパワー1/32、シャッタースピード1/200、絞りF2.8、ISO400を設定します。オートフォーカス機能と手ぶれ補正機能がオフになっていることを確認します。 メモ: これらの設定は、最適なフラッシュ照明、シャッタースピード、および被写界深度のバランスを取ります。他の倍率やレンズの組み合わせに合わせて調整する必要があります。</li>
	<li>結果の画像スタック(10〜50枚の画像)を保存する場所を目的のファイルフォルダに設定します。イメージに十分なストレージ容量を確保します (イメージあたり ~8.5 MB)。</li>
	<li>自動距離モードのスタックショットコントロールユニットのフォーカススタック設定を調整します。<ol>
		<li>ステップサイズを5μmに設定し、フォーカススタックの開始位置と停止位置を設定してステップ数を計算します。</li>
		<li>ライブビューモードで試料を表示し、カメラをオートシュートモードで表示して、開始位置と停止位置を特定します。</li>
		<li>試験片の最も近い部分にピントが合うようにレールを動かし( 開始 位置を設定)、次に最も関心のある特徴がピントが合っている場所 (終了位置 を設定)に移動します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>カメラを マニュアル撮影 モードに戻し、スタックショットコントロールユニットから画像取得を開始します。 注:画像取得時間は、試料のサイズによって異なります。大きな試料に必要な被写界深度が深いほど、画像スタックに含まれるスライスが多くなり、全体の取得時間が長くなります。</li>
	<li>参照されているフォーカススタッキングソフトウェアでファイルを開きます。スタック イメージを生成するには、[ スタック] |Align &amp; Stack All (PMax) (すべて揃えてスタック)</li>
	<li>最終イメージをコンピュータのハードドライブに.tifファイルとして保存するには、[ ファイル] |出力画像を保存します。 注:積み重ねられた画像ファイルの解像度と画像化する標本の数によっては、画像のバックアップに大容量の外付けハードドライブ(1 TB)が必要になる場合があります。このプロトコルでは、スタックされた画像は圧縮される前にそれぞれ約 100 MB です。</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig03.jpg"> 
図3:画像取得(A)画像取得装置と、次のようにラベル付けされた部品:a)デジタル一眼レフカメラ本体;b)望遠レンズ;c)20x APO顕微鏡対物レンズとアダプター。d)フラッシュ;e)レンズとドームディフューザー。f)スタックショットコントローラー、マクロレール、ロータリーステージ。g)ユニバーサルステージジンバル。h)三脚。(B)光拡散器が設置されたイメージング装置。(C)イメージング用の位置にマウントされた標本のクローズアップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
4.成人の目の面積を計算するためのFIJI分析ワークフロー
<ol>
	<li>画像分析のために、ImageJ.net のウェブサイトからFIJIソフトウェア15 を入手してください。</li>
	<li>分析用の画像は、目が中央に配置され、適切な照明と最小限の周辺ぼかしで位置合わせされている画像を選択し、カメラとの適切な位置合わせを示しています。</li>
	<li>画像の縮尺を調整します。<ol>
		<li>500 μmに対応する20倍の倍率のスケールバー画像をダウンロードしてください。あるいは、画像取得時に、同じ設定で定規を撮影することもできます。FIJIソフトウェアで画像を開きます。</li>
		<li>スケールバーの長さを測定します(図4A)。 直線ツールを使用して 、ラインを正確にトレースします。 [分析] |測定します。このピクセル距離は 500μm に相当します(図4B)。</li>
		<li>ミクロンあたりのピクセル数を計算します。これを使用して、ピクセル測定値をマイクロメートル測定値に変換します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>FIJIでスタックイメージファイルを開きます(図4C)。</li>
	<li>ツールバーから「 虫眼鏡 」を選択して、フォーカス領域を拡大します。目とすぐ近くの頭のキューティクルで画面いっぱいにしてみてください(図4D)。</li>
	<li>ツールバーから 「フリーハンド選択ツール」 を選択します。網膜領域の輪郭をできるだけ密接に描き、最も外側の眼球列の輪郭に沿って描きます(図4E)。選択範囲の一部を削除するには、 オプション ボタンを押したまま、削除するピクセルを選択します。選択に追加するには、 option ボタンと shift ボタンを押したまま、追加するピクセルを選択します。</li>
	<li>面積を計算するには、[ 分析] | トップメニュー(図4F)から測定します。新しいウィンドウが表示され 、面積、平均、最小 、 および最大 パラメーターが表示されます。これらのデータをコピーしてスプレッドシートに貼り付け、ピクセル単位からマイクロメートル単位への変換と文書化を行います。</li>
	<li>適切な統計分析を実行します。</li>
</ol>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig04.jpg"> 
図4:FIJIでの画像分析 (A)元の画像をスケーリングします。キャリブレーション画像をダウンロードして、500 μmバーの長さを測定します。(B)スケールの設定機能を使用してスケーリングを調整します。(C)積み重ねた画像を開きます。(D)目が中央に集まり、ほぼ全画面表示になるように画像を拡大します。(E)フリーハンド選択ツールを使用して、オマチディアの最も外側の列と周囲のキューティクルとの間の境界で目の輪郭を描きます。(F)選択した領域内の面積を測定するには、[分析]をクリックします|メジャー |面積。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<meta charset="utf8"></head><body>ショウジョウバエの眼の欠損の高解像度イメージングと解析

<ol><li>Rubin, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+of+the+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics of the eukaryotes.</a> Science. 287 (5461), 2204-2215 (2000).</li>
<li>Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+tools+and+assays+for+the+study+of+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Drosophila tools and assays for the study of human diseases.</a> Dis Model Mech. 9 (3), 235-244 (2016).</li>
<li>Hodgson, J. A., Parvy, J. -P., Yu, Y., Vidal, M., Cordero, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+models+of+invasive+tumorigenesis+for+in+vivo+studies+on+tumour%2Fperipheral+host+tssue+interactions+during+cancer+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval models of invasive tumorigenesis for in vivo studies on tumour/peripheral host tssue interactions during cancer cachexia.</a> Int J Mol Sci. 22 (15), 8317(2021).</li>
<li>Lam Wong, K. K., Verheyen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+reprogramming+in+cancer%3A+mechanistic+insights+from+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Metabolic reprogramming in cancer: mechanistic insights from Drosophila.</a> Dis Model Mech. 14 (7), dmm048934(2021).</li>
<li>Bonini, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+Drosophila+genetics+and+its+insight+into+human+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A perspective on Drosophila genetics and its insight into human neurodegenerative disease.</a> Front Mol Biosci. 9, e1060796(2022).</li>
<li>Drummond-Barbosa, D., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reclaiming+Warburg%3A+using+developmental+biology+to+gain+insight+into+human+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Reclaiming Warburg: using developmental biology to gain insight into human metabolic diseases.</a> Development. 147 (11), dev189340(2020).</li>
<li>Ready, D. F., Hanson, T. E., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+Drosophila+retina%2C+a+neurocrystalline+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the Drosophila retina, a neurocrystalline lattice.</a> Dev Biol. 53 (2), 217-240 (1976).</li>
<li>Johnson, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hexagonal+patterning+of+the+Drosophila+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Hexagonal patterning of the Drosophila eye.</a> Dev Biol. 478, 173-182 (2021).</li>
<li>Weasner, B. P., Kumar, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+early+history+of+the+eye-antennal+disc+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The early history of the eye-antennal disc of Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 221 (1), iyac041(2022).</li>
<li>Pichaud, F., Casares, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+an+optical+dome%3A+The+size+and+shape+of+the+insect+compound+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Shaping an optical dome: The size and shape of the insect compound eye.</a> Semin Cell Dev Biol. 130, 37-44 (2022).</li>
<li>Oster, I. I., Crang, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+electron+microscopy+of+Drosophila+mutant+and+wild+type+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Microsc+Soc%22%5BJournal%5D)">Scanning electron microscopy of Drosophila mutant and wild type eyes.</a> Trans Am Microsc Soc. 91 (4), 600-602 (1972).</li>
<li>Gibb, T. J., Oseto, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGibb%2C+TJ+%22Insect+collection+and+identification%3A+Techniques+for+the+field+and+laboratory%22">Insect collection and identification: Techniques for the field and laboratory</a>. , Academic Press. (2019).</li>
<li>Mertens, J., Roie, M. V., Merckx, J., Dekoninck, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+low+cost+compact+cameras+with+focus+stacking+functionality+in+entomological+digitization+projects%5BTitle%5D)+AND+%22ZooKeys%22%5BJournal%5D)">The use of low cost compact cameras with focus stacking functionality in entomological digitization projects.</a> ZooKeys. 712, 141-154 (2017).</li>
<li>Brown, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+further+chemical+alternative+to+critical-point-drying+for+preparing+small+%28or+large%29+flies%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+Times%22%5BJournal%5D)">A further chemical alternative to critical-point-drying for preparing small (or large) flies.</a> Fly Times. 11, 10(1993).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Method%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Method. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Grillo-Hill, B. K., Choi, C., Jimenez-Vidal, M., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+H%2B+efflux+is+sufficient+to+induce+dysplasia+and+necessary+for+viability+with+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Increased H+ efflux is sufficient to induce dysplasia and necessary for viability with oncogene expression.</a> eLife. 4, e03270(2015).</li>
<li>White, K. A., Grillo-Hill, B. K., Barber, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+behaviors+mediated+by+dysregulated+pH+dynamics+at+a+glance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Cancer cell behaviors mediated by dysregulated pH dynamics at a glance.</a> J Cell Sci. 130 (4), 663-669 (2017).</li>
<li>Peralta, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+Nhe2+overexpression+induces+autophagic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Drosophila Nhe2 overexpression induces autophagic cell death.</a> Mol Biol Cell. 35 (7), br13(2024).</li>
<li>Munnik, C., Xaba, M. P., Malindisa, S. T., Russell, B. L., Sooklal, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster%3A+A+platform+for+anticancer+drug+discovery+and+personalized+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster: A platform for anticancer drug discovery and personalized therapies.</a> Front Genet. 13, 949241(2022).</li>
<li>Nitta, Y., Sugie, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+neurodegenerative+diseases+using+Drosophila+and+the+development+of+novel+approaches+for+their+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Fly%22%5BJournal%5D)">Studies of neurodegenerative diseases using Drosophila and the development of novel approaches for their analysis.</a> Fly. 16 (1), 275-298 (2022).</li>
<li>Pletcher, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+screen+using+the+Drosophila+melanogaster+TRiP+RNAi+collection+to+identify+metabolic+enzymes+required+for+eye+development%5BTitle%5D)+AND+%22G3%3A+Genes%7CGenomes%7CGenetics%22%5BJournal%5D)">A genetic screen using the Drosophila melanogaster TRiP RNAi collection to identify metabolic enzymes required for eye development.</a> G3: Genes|Genomes|Genetics. 9 (7), 2061-2070 (2019).</li>
<li>Bangi, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+personalized+platform+identifies+trametinib+plus+zoledronate+for+a+patient+with+KRAS-mutant+metastatic+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">A personalized platform identifies trametinib plus zoledronate for a patient with KRAS-mutant metastatic colorectal cancer.</a> Sci Adv. 5 (5), eaav6528(2019).</li>
</ol>

ショウジョウバエ・メラノガスターは、分子シグナル伝達経路や細胞の挙動を解明するために何十年にもわたって使用されてきた強力な遺伝モデル生物です。多細胞発生に不可欠な進化的に保存されたシグナル伝達経路の多くが、ショウジョウバエで初めて同定され、その作用機序が定義された。ヒトの疾患関連遺伝子の約65-75%がショウジョウバエ1,2にオルソログを持っています。成体のショウジョウバエの眼は、がん3,4、神経変性5、代謝障害6などのヒト疾患に関与する重要な保存遺伝子の発見を促進する偏りのない遺伝的スクリーニングを可能にした重要なモデルです。
ショウジョウバエの眼は、オマチディアと呼ばれる~800単位の眼で構成され、これらは成虫の眼7の表面を横切る六角形のパターンで正確に配列されています。各オマチジウムは、非対称の台形内の異なる位置を占める8つの視細胞ニューロンで構成されています。これらは、4つの非神経錐体細胞と2つの一次色素細胞によって支えられており、レンズと疑似錐体を分泌して光受容体ニューロンの光感知ラブドームに光を集中させます。隣接するommatidiaは、二次色素細胞、三次色素細胞、および機械感覚剛毛複合体8,9,10で構成される、骨間格子細胞の1列によって分離されている。
眼の発達の摂動は、成人の眼では、眼の大きさの増加または減少、レンズや剛毛の異常な存在量または構造、または通常は不変の六角形のパターンが乱され、眼の表面を横切って眼球の列をたどることができなくなる「粗い目」として見られます。これらの表現型は、解剖顕微鏡を使用して肉眼組織レベルでスコアリングできます。表現型の詳細な分析には、従来、走査型電子顕微鏡とそれに続く定量的画像分析が含まれます11。しかし、走査型電子顕微鏡には、高価な装置、高価な試薬、数日にわたるサンプル調製、そして多くの場合、フルタイムのスタッフのメンテナンスが必要です。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig01v2.jpg"> 
図1:成体の ショウジョウバエ の構造をイメージングするためのワークフロー。 (A)成虫の ショウジョウバエを 70%エタノールに集めて固定します。(B)イメージング用のサンプルをポイントマウントしてピンに貼り付けます。(C)焦点合成と統合により高解像度の画像を取得します。(D)FIJIを使用して画像を定量化します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
この論文では、比較的安価で、サンプル調製時間が短く、3フィートのラボベンチに簡単に設置でき、危険物を必要とせず、 ショウジョウバエ の研究ラボに長期間追加できるワークフローを紹介しています(図1)。ポイントマウントは、 ショウジョウバエ12などの小さくて柔らかい体の昆虫を風乾して保存するために使用される昆虫学的手法です。この方法は、顕微鏡の対物レンズと高解像度のデジタル一眼レフカメラを組み合わせて、10倍から1,000倍の有効倍率を実現することに依存しています。マクロ写真に固有の限られた被写界深度は、フォーカススタッキングによって克服されます:焦点面が目的の標本13を移動する一連の画像をつなぎ合わせます。この方法では、表現型の定量に適した高解像度の画像が得られ、翼、脚、胸部、腹部など、他の関心のある構造にも簡単に適応できます。画像解析ワークフローは、無料の画像解析プログラムFIJI(NIH ImageJ)を使用しています。この方法論により、サンプル調製、高解像度イメージング、および分析は、リソースが不足している機関の学部生や科学者が利用できるようになります。

<table><tbody><tr><td>1 mL 血清学的ピペット</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>170353N</td><td></td></tr><tr><td>1.7 mL 微量遠心チューブ</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>24-282LR</td><td></td></tr><tr><td>20x APO顕微鏡対物レンズ</td><td>ミツトヨ(株)</td><td>378-804-3</td><td></td></tr><tr><td>アーカイブ 65 ポンド厚紙&nbsp;</td><td>ニーナ株式会社</td><td>91901</td><td></td></tr><tr><td>Canon EF 70-200 mm USM II 望遠レンズ</td><td>Canon</td><td>3044C002</td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS 6D Mark II DSLR カメラ本体</td><td>Canon</td><td>1897C002</td><td></td></tr><tr><td>ディフューザードーム</td><td>巨視的ソリューション&nbsp;</td><td>PA-DIF-GIM-SM</td><td></td></tr><tr><td>ミツトヨ M プラン用 ディフューザー APO 対物</td>レンズ <td>マクロスコープ ソリューション&nbsp;</td><td>ミツトヨディフューザー</td><td></td></tr><tr><td>ショウジョウバエバイアルとプラグジェ</td><td>ネシーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>32-117BF</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5 細い先端の鉗子</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>NC9889584</td><td></td></tr><tr><td>ガチョウの羽</td><td>アマゾン</td><td>B01CMMJI6U</td><td></td></tr><tr><td>ヘビーデューティ 陽極酸化アルミニウム三脚</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>TFA-32G</td><td></td></tr><tr><td>キムワイプ</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>06-666A</td><td>糸くずの出ない実験用ティッシュ</td></tr><tr><td>レーベンハック M1000 Plus デジタルカメラ</td><td>Levenhuk</td><td>70358</td><td></td></tr><tr><td>No. 3 取り付けピン</td><td>Indigo Instruments</td><td>33414-3</td><td></td></tr><tr><td>Nutri-Fly Bloomington Drosophila media</td><td>Genesee Scientific&nbsp;</td><td>66-113</td><td>フライフード</td></tr><tr><td>ポイントパンチ</td><td>MCミースマニュファクチャリング株式会社</td><td>448Detail</td><td></td></tr><tr><td>スクリューノブクランプ</td><td>Really Right Stuff, LLC</td><td>SK-Clamp</td><td>マクロレールを三脚に取り付けるため</td></tr><tr><td>Stackshot Controller and Macro Rail</td><td>Cognisys Inc.</td><td></td><td></td>ST3X_100_BUNDLE</tr>降<tr><td>圧リングアダプタ&nbsp;</td><td>RAFカメラ</td><td>763461174207</td>顕微鏡<td>の対物レンズをカメラレンズに接続するためのレンズアダプター</td></tr><tr><td>Titebond Glue</td><td>Franklin International</td><td>5013</td><td></td></tr><tr><td>Yongnuo YN-24-EX Macro Twin Lite Flash</td><td>Shenzhen Yongnuo Photographic Equipment Co.</td><td>YN-24EX</td><td></td></tr><tr><td>ソフトウェア</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Canon EOS Utility (v. 3.16.1).&nbsp;</td><td>キヤノン</td><td></td><td>の買収ソフトウェア</td></tr><tr>である<td>FIJI</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td>Fijiは、GNU General Public Licenseの下でオープンソースとしてリリースされています。&nbsp;FIJIバージョン2.14.0/1.54f&nbsp;</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad Software, Boston, Massachusetts USA</td><td></td><td>Prism Version 10.3.1</td></tr><tr><td>Zerene Stacker (v.1.04)</td><td>Zerene Systems, LLC</td><td></td><td>Focus Stacking Software</td></tr></tbody></table>

成人の ショウジョウバエ の外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー

A Rapid, Simple Workflow for Quantification of External Adult Drosophila Structures

ショウジョウバエの目は、組織のパターン形成、成長制御、および細胞死を研究するための優れたモデルシステムです。私たちは最近、細胞内pH(pHi)が組織の成長にどのように影響するかを調査した研究を発表しました。まず、発育中の眼におけるナトリウム-プロトン交換体DNhe2(哺乳類NHE1のオルソログ)の過剰発現がパターニング欠陥と増殖の増加を引き起こす遺伝システムを確立した16。pHiが高いほど増殖の増加は、酵母から哺乳類まで、種全体で観察されます17。しかし、pHiが増加すると、大人の目は対照と比較して小さく見えることも観察されました。
成人の眼領域の定量分析を行い、 DNhe2 発現の上昇が ショウジョウバエ の眼の組織サイズをどのように減少させるかを決定しました。まず、眼球インサート顕微鏡(図5A)を用いて低解像度の画像を取得しましたが、定量的な測定を行うには品質が不十分でした。具体的には、目のエッジにピントが合っていないため、目の領域を正確に測定できません。
成虫のショウジョウバエの目の高解像度画像で各目の面積を測定しました(図5B)。GMR&gt;DNhe2発現ハエは、遺伝的バックグラウンドコントロールw1118ハエ(平均125.83μm2)またはヘテロ接合ハエGMRGAL4ドライバーコントロール(平均142.49μm2)よりも有意に小さい眼(平均74.28μm2)を示し、これはそれぞれ面積が41%および48%減少しました(図5C)。この眼の大きさの減少は、増殖が進んでいるにもかかわらず、細胞死のレベルが上昇していることに起因する可能性があります。
ファゴフォア形成を誘導するAtg1を含む既知のオートファジー遺伝子を遺伝的相互作用の研究に使用しました(図5)。成人の目の大きさへの影響は、高解像度の写真撮影とエリア分析を使用して定量化されました(図5B)。眼のサイズは、GMR&gt;DNhe2単独と比較してAtg13のヘテロ接合体で129.9μm2対74.28μm2)回復し(129.9μm2対74.28μm2)、GMR&gt;DNhe2単独と比較して、対照と同様でした(図5C)。分子マーカー解析と組み合わせることで、私たちの結果は、より高いpHiでのオートファジー細胞死の増加を支持しています。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67485/67485fig05.jpg"> 
図5:オートファジーの減少に伴う細胞内pHの上昇に伴う網膜サイズの減少のレスキュー。(A)眼球インサート顕微鏡で撮影した成虫のハエの目の低解像度画像。(B)次の遺伝子型の目のサイズ定量化に使用される成虫のハエの目の高解像度画像:w1118;GMRGAL4;GMR&gt;DNhe2;GMRGAL4;Atg13;GMR&gt;DNhe2;Atg13.(C)測定された成人の平均眼のサイズは、w1118(125.83μm2、N = 7)でした。GMRGAL4(142.49μm2、N=9)、およびGMR&gt;DNhe2(74.28μm2、N=6)、GMRGAL4;Atg13 (146.4 μm2, N = 15);GMR&gt;DNhe2;Atg13 (129.9 μm2, N = 19) であり、四分位範囲の中央値を示すことによって示されます。統計的有意性は、Welchの補正を併用した対応のないt検定によって決定されました。BとCのデータは以前に公開されました18。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67485/67485fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
私たちの結論は、サンプル調製、高解像度イメージング、およびここで説明した分析によって強化されます。これらの方法により、さまざまな遺伝子型を持つ成虫の ショウジョウバエ の目のサイズを正確かつ定量的に説明することができました。私たちは、pH依存性の成長制御のメカニズムを解明する他の遺伝的相互作用を評価するために、このアプローチを引き続き使用しています。

The Drosophila compound eye is a precisely patterned tissue that has revealed molecular mechanisms and biological processes that drive morphogenesis. It ...

a-rapid-simple-workflow-for-quantification-external-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

ショウジョウバエの飛行筋は、筋肉の発達と生理学のモデルシステムとして使用されます。このビデオでは、成体の飛行筋組織について説明し、蛹からのRNAシーケンシングに適した発達中の間接飛行筋を解剖するためのプロトコルに焦点を当てています。...

ショウジョウバエ後期蛹間接飛行筋(IFM)解剖:ハイスループット組織収集の方法

細胞内小器官の形態、サイズ、位置は進化的に保存されており、その機能に直接影響を与えるようです。これらのプロセスの根底にある分子メカニズムを理解することは、現代生物学の重要な目標となっています。ここでは、定量的手法の適用により、これらの研究がどのように促進されるかを示します。...

なぜ定量事項：での表現型のキャラクタリゼーション<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;幼虫の神経筋接合部

大人ショウジョウバエの脳は神経回路、高次脳機能、および複雑な疾患を研究するための貴重なシステムです。小さなハエの頭から全脳組織を分析するための効率的な方法は、脳ベースの研究を促進します。ここでは、よく保存された形態を有する成人の脳の簡単な、ワンステップ解剖プロトコルを記述します。...

大人のホールマウントの準備のためのシンプルなワンステップ解剖プロトコル<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;ブレインズ

二つの画像解析アルゴリズム、「 ショウジョウバエ NMJ形態計測」および「 ショウジョウバエ NMJブートン形態計測を」自動的ショウジョウバエ神経筋接合部（NMJ）の9つの形態学的特徴を定量化するために、 作成されました 。...

高スループットとのマルチパラメトリック定量化のための2個のアルゴリズム<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;神経筋接合部形態

この研究は、デジタル画像解析を用いてショウジョウバエの腹部色素沈着を迅速かつ正確に定量化する方法を提示する。この方法は、表現型の取得とデータ解析との間の手順を合理化し、標本のマウント、画像取得、画素値抽出、形質測定を含む。...

腹部色素沈着の定量化<em&gt;ショウジョウバエmelanogaster</em

このプロトコルは当てて神経細胞樹状パターン形成の複雑さ (NDAC)...

ショウジョウバエのニューロン樹状分枝複雑さの定量解析

このプロトコルは、若年のショウジョウバエメラノガスター血球が食細胞細菌に対する能力を評価および定量するために使用される貪食のインビボアッセイを記述する。...

インビボファゴサイトーシスアッセイを用いた成人ショウジョウバエのメラノガステル血球の年齢特異的食細胞能力の評価

マイクロコンピュータ断層撮影を用いた開発のあらゆる段階で、無傷の ショウジョウジョウバエメラノガスター...

微小断層撮影による ショウジョウバエメラノガスター の動物全体イメージング

ショウジョウバエの眼系は、さまざまな生物学的プロセス、特にヒトの神経変性疾患を研究するための有用なツールです。しかし、粗眼の表現型の手動定量化は偏りがあり、信頼性に欠ける可能性があります。ここでは、ilastikとFlynotyperを使用して、偏りのない方法で眼の表現型を定量化する方法について説明します。...

ショウジョウバエの眼の表現型の定量化:ilastikとFlynotyperを統合した計算アプローチ

Expansion-Assisted Iterative Fluorescence In Situ Hybridization(EASI-FISH)は、拡大顕微鏡法と蛍光in...

Expansion-assisted iterative Fluorescence In Situ Hybridizationを用いたInsact Drosophila Brainにおける遺伝子発現のマルチプレックス検出

学ぶ 低コストで高解像度のイメージングプロトコルを用いて、成人Drosophilaの眼の成長とパターニング欠陥を定量化する方法。がん進行に関連する細胞内pH動態の影響をin vivoで評価する実用的ツールです。

成人のショウジョウバエの外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー

さらに動画を探す

成人の ショウジョウバエ の外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー

さらに動画を探す

成人のショウジョウバエの外部構造を定量するための迅速でシンプルなワークフロー