In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

歯科用プラットフォームバイオフィルムは、口腔上皮の炎症を引き起こし、歯肉炎などの病気を引き起こす可能性のある数百の微生物で構成されています。私たちは、器官型組織モデルを使用して、これらの相互作用をより深く理解したいと考えています。これらのシステムは、制御された方法で代替治療法を評価するための有用なプラットフォームを提供します。

このように、近年のシーケンシング技術の進歩は、感染生物学の分野を変革しています。これらの技術により、プロテオミクス、トランスクリプトーム、メタボロームレベルでの宿主と微生物の特徴の評価を通じて、複数のOMICs技術を使用して、宿主病原体の相互作用を真に調査することができます。私たちの最近の研究では、バイオフィルム関連感染症における王国間および多微生物間の相互作用の重要性が強調されています。

in-vitroモデルシステムを使用することで、RAMや分光法などの革新的な技術を用いて、宿主バイオフィルムの相互作用を調査し、新規の抗バイオフィルム治療薬を試験し、微生物群集をプロファイリングすることができました。これらの器官型組織モデルを用いた今後の研究では、微生物と宿主組織および培養物のマルチOMICシグネチャーとプロファイリングを一緒に達成することを目指します。私たちは、バイオフィルムモデルにおいて、宿主と特定の細菌や真菌種との間の複雑な相互作用を明らかにし、解明したいと考えています。

まず、連鎖球菌種を含む多孔質ビーズの凍結茎を摂氏80度から取り除きます。5%の滅菌除細動馬の血液を含むコロンビアブラッドオーガーベースプレートで連鎖球菌種を復活させます。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。

翌日、プレートから3〜4コロニーを10ミリリットルのトリプトン大豆ブロス培地に移します。ブロスを摂氏37度、二酸化炭素5%で16〜18時間培養します。インキュベーション後、細胞懸濁液を3, 000Gで20°Cで5分間遠心分離する。

細胞ペレットを10ミリリットルの滅菌PBSで洗浄します。ペレットを10ミリリットルのPBSに再懸濁し、550ナノメートルに設定された分光光度計を使用して、各連鎖球菌種の懸濁液を個別に標準化します。標準化に続いて、各連鎖球菌懸濁液を1〜10に希釈して、トッドヒューイットブロスとロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地の1対1の混合物で1×10の濃度になるようにします。

希釈した細胞懸濁液500マイクロリットルを、13ミリメートルのヒドロキシアパタイトディスクを含む24ウェルマイクロタイタープレートにピペットで移します。培養物を摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートし、バイオフィルムの形成を可能にします。同様に、5%の滅菌除細動馬の血液を含む、気難しい嫌気性オーガーベースで嫌気性微生物を培養します。

各嫌気性微生物を特定の吸光度に標準化し、トッド・ヒューイットのブロスとロズウェル・パーク・メモリアル・インスティテュートの培地を1対1で混合して希釈します。連鎖球菌のバイオフィルムが成熟した後、付着していない細胞と使用済み培地をウェルから慎重に取り除きます。4つの嫌気性微生物の懸濁液1ミリリットルあたり7細胞の累乗に、標準化された1×10の500マイクロリットルを各ウェルに加えます。

バイオフィルムを37°Cの嫌気性条件下で24時間インキュベートします。翌日、接着していない細胞と使用済み培地をウェルから取り除きます。500マイクロリットルの滅菌1対1の混合物をトッドヒューイットブロスとロズウェルパークメモリアルインスティテュート培地に加えます。

バイオフィルムを嫌気性条件下で24時間培養します。7日目に、バイオフィルムを500マイクロリットルの滅菌PBSで2回洗浄して共培養します。まず、ヒト口腔上皮またはHOE組織と培地を開梱し、クラス2の安全キャビネットに移します。

ティッシュに付属のメンテナンス培地1ミリリットルを12ウェルプレートの各ウェルに加えます。滅菌ピンセットを使用して、HOE組織を含むポリカーボネートインサートを栄養オーガーと24ウェルシッピングプレートから取り外します。組織を調製した12ウェルプレートに移します。

組織モデルを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートして、実験室条件に順応させます。一方、ハイドロキシアパタイトディスクからバイオフィルムを除去するには、19ゲージの針とピンセットを使用して、24ウェルプレートの底からディスクを持ち上げます。ディスクを1ミリリットルの滅菌DPBSを含むビジューに移します。

ディスクを35キロヘルツで10分間、超音波処理水浴で超音波処理します。順応後、ピンセットを使用して組織インサートを12ウェルプレートから取り外します。バイオフィルムの100マイクロリットルをピペットで固定し、懸濁液を直接組織モデルに超音波処理します。

インサートを、1ミリリットルの新鮮なメンテナンスメディアが入った別の12ウェルプレートに移します。組織モデルを摂氏37度、二酸化炭素5%で24時間インキュベートします。組織処理のために、2ミリリットルのスクリューキャップOリングチューブに1%ビームメルカプトエタノールを含む350マイクロリットルのRLT溶解バッファーを調製します。

チューブに約100マイクロリットルの0.5ミリメートル酸洗浄ガラスビーズを追加します。ピンセットを使用して、組織を含むインサートを培地から取り出し、インサートから残っている微生物懸濁液を廃棄します。インサートを目の高さで逆さまに保持し、19ゲージの針を使用して、インサートの底から組織とメンブレンを慎重にスライスします。

組織とメンブレンを調製したRLTバッファーに移します。ベンチトップビーズビーダーホモジナイザーを使用して、組織を30秒間均質化します。得られたライセートからRNAを抽出します。これは、製造元のRNA抽出キットの指示に従ってください。

プロテオミクス分析のために残りの使用済み組織培地を、ロースループットおよびハイスループットの方法を使用して収集します。HOE組織における炎症性バイオマーカーの遺伝子発現は、バイオフィルム超音波処理への曝露後に、刺激されていない対照と比較して有意にアップレギュレーションされました。最も大きな倍率変化が観察されたのは、CCL2、CXCL1、およびCSF3でした。

HOE組織におけるIL8 mRNA発現は、バイオフィルムソニケートによる刺激後、対照組織と比較して8.67倍に増加しました。使用済み培地中のIL8タンパク質レベルは、対照組織では1.005ナノグラム/ミリリットルから、バイオフィルム超音波処理刺激組織では4.245ナノグラム/ミリリットルに増加しました。