Name: In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: 学ぶ器官型組織モデルを用いた宿主-病原体相互作用のin vitro研究法。人口腔上皮とバイオフィルム微生物の相互作用を解析し、炎症応答メカニズムを解明する。

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<table><tbody><tr><td>13 mmハイドロキシアパタイト(HA)ディスクPlasma</td><td>Biotal</td><td>Limited n / a(受注生産)</td><td>歯の表面を模倣した口腔バイオフィルム形成用基板</td></tr><tr><td>19 G針(40 mm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>613-2028</td><td>プレートからのHAディスクの取り外しや、</td></tr><tr><td>蓋付き24ウェルTC処理平底マイクロタイタープレート</td>のインサートから組織を切り出すために使用されます&nbsp;<td>科学研究所用品</td><td>3524 (100個入り)</td><td>バイオフィルムおよび組織共培養実験の培養用プレート</td></tr><tr><td>酸洗浄ガラスビーズ (425-600 &mu;m)</td><td>メルク:Sigma-Aldrich</td><td>G8772</td><td>RNA抽出の収量を改善するための組織溶解用&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>Actinomyces naeslundii DSM 17233&nbsp;</td><td>ライプニッツ研究所DSMZ</td><td>n / a</td><td>複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ</td></tr><tr><td>ビーズミル24ホモジナイザー(または同等品)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-163</td><td>RNA抽出の収量を改善するための組織溶解&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>ビジュー&nbsp;(7mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>189170 (700個/袋)</td><td>バイオフィルムの超音波処理に使用&nbsp;&nbsp;</td></tr><tr><td>cDNA合成キット(大容量)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4368814(200反応用)</td><td>組織RNAコロンビア</td></tr><tr><td>血液寒天培地(CBA)塩基</td>からのcDNA合成&nbsp;<td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>CM0331B(500グラム用)</td><td>好気性微生物を培養するためのCBAプレートの調製に使用されます</td></tr> 除<tr><td>細動馬の血液</td><td>E&O Laboratories</td><td>DHB</td><td>好気性および嫌気性微生物を培養するためのCBAおよびFAAプレートを補うために使用されます</td></tr><tr><td>ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水(dPBS:CaClなし<>sub2およびMgCl2)</td><td>Merck:バイオ</td><td>フィルム超音波処理剤</td>Fusobacterium nucleatumとの細胞共培養のためのSigma-Aldrich <td>DB537</td> dPBS</tr><tr><td>ATCC 10953</td><td>American Type Culture Collection</td><td>n/a</td><td>複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の一つ</td></tr><tr><td>Fusobacterium nucleatum 亜種 (subspp.) vincentii DSM 19507</td><td>ライプニッツ研究所 DSMZ</td><td>n/a</td><td>複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の一つ</td></tr><tr><td>GraphPad Prism (Version 10)</td><td>GraphPad Software, Inc</td>. <td>n/a</td><td>グラフ作成およびデータ分析用&nbsp;</td></tr><tr><td>ヒトIL-8 ELISAキット(プレート付きコーティングされていないELISAキット)</td><td>Thermo Fisher Scientific (Invitrogen)</td><td>88-8086-86 (10 x 96 tests用)</td><td>使用済み組織培地のタンパク質評価用ELISAキットおよびプレート</td></tr><tr><td>Human Oral Epithelium (HOE)&nbsp;</td><td>エピスキン</td><td>n/a (受注生産品)</td><td>共培養モデルシステムに利用される上皮組織</td></tr><tr><td>接種ループ (使い捨て、10 &micro;L、または同等)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>12870155 (1000個入り)</td><td>固体および液体培地での微生物学的培養用</td></tr><tr><td>MicroAmp Fast Reaction 96-well qPCR plates (0.1 mL)&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>4346907(10プレート用)</td><td>組織マイクロバンクビーズのqPCR遺伝子発現プロファイリング用</td></tr><tr><td></td><td>Pro-Lab Diagnostics</td><td>PL.170</td><td>微生物の保管とcyropreservation &nbsp;</td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM9935 (10 x 1.5 mL)</td><td>RT-PCR grade water for qPCR experiments&nbsp;</td></tr><tr><td>シャーレ(90mm)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック(ステリリン)&nbsp;</td><td>11309283(500個入り)</td><td>微生物培養用寒天プレートの調製に使用</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>18912014(100錠入り)</td><td>微生物の標準化とバイオフィルム洗浄ステップのためのPBS</td></tr><tr><td>Rneasyミニキット</td><td>Qiagen</td><td>74106(250反応用)</td><td>組織用カラムベースのRNA抽出キット&nbsp;</td></tr><tr><td>ロズウェルパークメモリアルインスティテュート1640ミディアム</td><td>メルク:シグマアルドリッチ</td><td>R7755-10L(10リットル用)&nbsp;</td><td>バイオフィルム培養用メディア&nbsp;</td></tr><tr><td>RT2プロファイラーアレイ</td><td>Qiagen</td><td>330171 (カスタムメイド)</td><td>遺伝子発現プロファイリング用の既製プライマーを含むqPCRアレイ</td></tr><tr><td>Schaedler anaerobe 寒天塩基</td><td>Merck: Sigma-Aldrich (Millipore)</td><td>91019 (for 500 g)</td><td>Fastdious Anaerobic Agar platesの調製に使用&nbsp;</td></tr><tr><td>Schaedler 嫌気性菌ブロス</td><td>&nbsp;</td><td>CM0497B(500g用)</td><td>嫌気性微生物増殖用液剤</td></tr><tr><td>スクリューキャップ ビーズバグOリングチューブ&nbsp;</td><td>科学研究所用品</td><td>Z763837-1000EA (1000個入り)</td> <td>ビーズミル 24 ホモジナイザーで使用し、組織を溶解する</td></tr><tr><td>超音波処理バス</td><td>フィッシャー サイエンティフィック (フィッシャーブランド)</td><td>該当なし</td><td>HA ディスクからのバイオフィルムの超音波処理用&nbsp;</td></tr><tr><td>Streptococcus intermedius DSM 20753&nbsp;</td><td>ライプニッツ研究所 DSMZ</td><td>n/a</td><td>複合体バイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ</td></tr><tr><td>Streptococcus mitis NCTC 12261</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a</td><td>複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ</td></tr><tr><td>Streptococcus oralis NTCC 11427&nbsp;</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a</td><td>複雑なバイオフィルムモデルに使用された微生物の1つ</td></tr><tr><td>SYBR-green (qPCRBIO SyGreen Mix Hi-ROX)</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB20.12</td><td>SYBR-green mix for qPCR&nbsp;</td></tr><tr><td>トッド・ヒューイット・ブロス</td><td>・メルク:シグマ・アルドリッチ</td><td>T1438&nbsp;</td><td>バイオフィルム培養用メディア&nbsp;</td></tr><tr><td>トリプトン大豆ブロス(TSB)培地</td><td>メルク:Sigma-Aldrich</td><td>22092(500 g用)</td><td>好気性微生物の増殖用液体培地</td></tr>ピン<tr><td>セット(150 mm、ステンレス鋼、鋸歯状)</td><td>RS-Pro&nbsp;</td><td>545-187</td><td>HAディスクおよび組織インサート/組織抽出物の移動に使用</td></tr><tr><td>ユニバーサルチューブ&nbsp;(30mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>201150 (400個/袋)</td><td>液体培養中の微生物培養用容器&nbsp;</td></tr><tr><td>Veillonella dispar NCTC 11831</td><td>National Collection of Type Cultures</td><td>n/a'One</td> <td>of the microorganisms used for the complex biofilm model</td></tr><tr><td>&beta;-metacapthoethanol</td><td>Merck: Sigma-Aldrich</td><td>M3148</td><td>RNase deactivation in tissue samples(組織サンプル中の</td>Sigma-Aldrich M3148 RNase deactivation</tr></tbody></table>)

in vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

この実験では、HOEは、口腔の健康から歯茎の炎症(歯肉炎として知られる)への移行の生物の代表である7種のバイオフィルムソニケートに曝露されました。この病気は、歯の表面に蓄積する歯垢からの微生物の摂動による歯肉または口腔上皮組織の炎症から生じます。刺激後、組織、および使用済み培地は、上述したように転写およびプロテオミクス解析に利用されます。この実験では、炎症性バイオマーカーのパネルの遺伝子発現が、バイオフィルム超音波処理による刺激後の組織で検出されました(図2)。これは、16 種類の遺伝子を含むカスタムメイドの RT2 PCR プロファイラーアレイを使用して達成され、ハウスキーピング遺伝子 GAPDH への標準化後の遺伝子発現は、刺激を受けていない組織に対する倍率変化として示されました。微生物刺激は、CXCL5を除くすべての遺伝子の発現を増加させ、NFKB、CCL2、CXCL1、CXCL3、CSF2、CSF3、TNF、IL1A、IL1B、およびTLR4に統計的な差が見られました(図2A)。最も大きな倍率変化が観察されたのはCCL2、CXCL1、およびCSF3で、それぞれ16.9、10.3、および15.1の増加でした(図2B)。
使用済みHOE培地は、刺激後に組織によって産生および放出されるタンパク質を検出するためのプロテオミクス分析に利用されました。これは、遺伝子発現がタンパク質産生と相関しているかどうかを判断するのに役立ちます。これを行うために、 IL8 遺伝子発現およびIL-8タンパク質放出を対照組織およびバイオフィルム超音波刺激組織で評価した(図3)。遺伝子発現は、前述の3に示すように、IL8およびGAPDHのプライマーを用いたSYBR-greenベースのqPCRを用いて評価した。HOEにおける IL8 mRNAの発現は、バイオフィルムソニケートによる刺激後に8.67倍に増加しました(図3A)。タンパク質レベルでは、IL-8 ELISAキットを使用してIL-8レベルを定量しました。使用済み培地中のIL-8の濃度は、対照組織における~1.005ng/mLからバイオフィルム超音波刺激組織における~4.245ng/mLに増加した(図3B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig01.jpg"> 
図1:器官型組織共培養モデルのさまざまなアプリケーション。 微生物の標準化された懸濁液を組織に直接適用して、種と宿主の相互作用を調査します(A)。これらは、短期間(例:&lt;24時間)の微生物のコロニー形成を評価するためによく使用されます。複雑なバイオフィルムは、分散した細胞またはバイオフィルム凝集体が組織に及ぼす影響を調べるために超音波処理されます(B)。これは重要ですが、以前には、そのような細胞はプランクトン性またはバイオフィルムの対応物と比較して独特の表現型を持っていることが示されています。この目的のために、無傷のバイオフィルムを、追加の小さなインサートを使用して組織に直接追加し、宿主との隣接露光を作り出すことができます(C)。最後に、プランクトン性細胞を適切な培地で組織に添加し、微生物のコロニー形成、バイオフィルム形成、および組織上の成長ダイナミクスを評価します(D)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig02.jpg"> 
図2:7種バイオフィルムソニケートによる刺激後のHOE組織の遺伝子発現 mRNA発現は、ハウスキーピング遺伝子GAPDHに正規化された合計15の炎症性遺伝子の倍率変化を、制御中のHOE組織で、刺激せずに、100μLの7種バイオフィルムソニケート(A)に曝露した。(B)は、mRNA発現の変化が最も大きい3つの遺伝子(CCL2、CXCL1、CSF3)を示しています。統計分析は、パラメトリック対応のないT検定を用いて実施され、有意な変化はそれぞれ*p &lt; 0.05、**p &lt; 0.01、***p は0.001&lt;示されました。データは、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用してプロットおよび分析されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67487/67487fig03.jpg"> 
図3:HOE組織によって産生されるIL8遺伝子発現とIL-8タンパク質レベル。 SYBR-greenベースのqPCR(A)およびELISA法を使用して使用済み組織培地から定量されたIL-8タンパク質レベルによって決定されたHOE組織におけるIL8のmRNA発現倍率変化(B)。統計分析は、パラメトリックな対応のない T 検定を使用して実施され、有意な変化は *p &lt; 0.05 および ****p &lt; 0.0001 として示されました。データは、統計ソフトウェアとグラフ作成ソフトウェアを使用してプロットおよび分析されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67487/67487fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

In Vitroでの宿主-病原体相互作用の研究のための器官型組織モデルシステム

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