Name: マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-03T14:20:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 学ぶマウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製法。免疫磁気分離で高純度を確保し、クロマチンアクセシビリティ解析を最適化します。免疫応答メカニズムの解明に役立ちます。

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<meta charset="utf8"></head><body>げっ歯類好中球におけるクロマチンアクセシビリティのためのスケーラブルなATAC-seqプロトコル

<ol><li>Mortaz, E., Alipoor, S. D., Adcock, I. M., Mumby, S., Koenderman, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+neutrophil+function+in+severe+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Update on neutrophil function in severe inflammation.</a> Front Immunol. 9, 2171(2018).</li>
<li>Lehrer, R. I., Ganz, T., Selsted, M., Babior, B. M., Curnutte, J. T. Neutrophils and host defense. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLehrer%2C+RI+%22Ann+Intern+Med%22">Ann Intern Med</a>. 109 (2), 127-142 (1988).</li>
<li>De Oliveira, S., Rosowski, E. E., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+migration+in+infection+and+wound+repair%3A+Going+forward+in+reverse%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil migration in infection and wound repair: Going forward in reverse.</a> Nat Rev Immunol. 16 (6), 378-391 (2016).</li>
<li>Herrera-Uribe, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+profiling+of+gene+expression+and+chromatin+accessibility+elucidates+specific+transcriptional+networks+in+porcine+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">Integrative profiling of gene expression and chromatin accessibility elucidates specific transcriptional networks in porcine neutrophils.</a> Front Genet. 14, 1107462(2023).</li>
<li>Kipnis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+in+sepsis%3A+Battle+of+the+bands%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Neutrophils in sepsis: Battle of the bands.</a> Crit Care Med. 41 (3), 925-926 (2013).</li>
<li>Kong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis-induced+thymic+atrophy+is+associated+with+defects+in+early+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Sepsis-induced thymic atrophy is associated with defects in early lymphopoiesis.</a> Stem Cells. 34 (12), 2902-2915 (2016).</li>
<li>Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+proteins%3A+Selling+cytokines+by+the+pound%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived proteins: Selling cytokines by the pound.</a> Adv Immunol. 73, 369-509 (1999).</li>
<li>Tecchio, C., Cassatella, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil-derived+cytokines+involved+in+physiological+and+pathological+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Immunol+Allergy%22%5BJournal%5D)">Neutrophil-derived cytokines involved in physiological and pathological angiogenesis.</a> Chem Immunol Allergy. 99, 123-137 (2014).</li>
<li>Newburger, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoimmune+and+other+acquired+neutropenias%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Autoimmune and other acquired neutropenias.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 38-42 (2016).</li>
<li>Skokowa, J., Dale, D. C., Touw, I. P., Zeidler, C., Welte, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+congenital+neutropenias%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Dis+Primers%22%5BJournal%5D)">Severe congenital neutropenias.</a> Nat Rev Dis Primers. 3, 17032(2017).</li>
<li>Burn, G. L., Foti, A., Marsman, G., Patel, D. F., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The neutrophil.</a> Immunity. 54 (7), 1377-1391 (2021).</li>
<li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis+induces+non-classic+innate+immune+memory+in+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sepsis induces non-classic innate immune memory in neutrophils.</a> Cell Rep. 42 (9), 113044(2023).</li>
<li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function%5BTitle%5D)+AND+%22Hematology+Am+Soc+Hematol+Educ+Program%22%5BJournal%5D)">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> Hematology Am Soc Hematol Educ Program. 2016 (1), 43-50 (2016).</li>
<li>Shaul, M. E., Fridlender, Z. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+neutrophils+in+patients+with+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated neutrophils in patients with cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 16 (10), 601-620 (2019).</li>
<li>Hong, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+in+neutrophil+differentiation+and+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Immune+Netw%22%5BJournal%5D)">Current understanding in neutrophil differentiation and heterogeneity.</a> Immune Netw. 17 (5), 298-306 (2017).</li>
<li>Carvalho, L. O., Aquino, E. N., Neves, A. C., Fontes, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neutrophil+nucleus+and+its+role+in+neutrophilic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">The neutrophil nucleus and its role in neutrophilic function.</a> J Cell Biochem. 116 (9), 1831-1836 (2015).</li>
<li>Tamassia, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cutting+edge%3A+An+inactive+chromatin+configuration+at+the+il-10+locus+in+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cutting edge: An inactive chromatin configuration at the il-10 locus in human neutrophils.</a> J Immunol. 190 (5), 1921-1925 (2013).</li>
<li>Shiraishi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+forces+mediated+by+respiration+maintain+lung+alveolar+epithelial+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biophysical forces mediated by respiration maintain lung alveolar epithelial cell fate.</a> Cell. 186 (7), 1478-1492.e15 (2023).</li>
<li>Chang, C. C., Sun, J. T., Chu, F. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+sepsis%2C+neutrophils+and+intracellular+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22QJM%22%5BJournal%5D)">Bacterial sepsis, neutrophils and intracellular organisms.</a> QJM. 110 (6), 393-394 (2017).</li>
<li>Walling, B. L., Murphy, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protean+regulation+of+leukocyte+function+by+nuclear+lamins%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Protean regulation of leukocyte function by nuclear lamins.</a> Trends Immunol. 42 (4), 323-335 (2021).</li>
<li>Sollberger, G., Tilley, D. O., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+extracellular+traps%3A+The+biology+of+chromatin+externalization%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Neutrophil extracellular traps: The biology of chromatin externalization.</a> Dev Cell. 44 (5), 542-553 (2018).</li>
<li>Klemm, S. L., Shipony, Z., Greenleaf, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+and+the+regulatory+epigenome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility and the regulatory epigenome.</a> Nat Rev Genet. 20 (4), 207-220 (2019).</li>
<li>Grandi, F. C., Modi, H., Kampman, L., Corces, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+accessibility+profiling+by+ATAC-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin accessibility profiling by ATAC-seq.</a> Nat Protoc. 17 (6), 1518-1552 (2022).</li>
<li>Khoyratty, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+transcription+factor+networks+control+neutrophil-driven+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Distinct transcription factor networks control neutrophil-driven inflammation.</a> Nat Immunol. 22 (9), 1093-1106 (2021).</li>
<li>Fischer, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Safeguard+function+of+pu.1+shapes+the+inflammatory+epigenome+of+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Safeguard function of pu.1 shapes the inflammatory epigenome of neutrophils.</a> Nat Immunol. 20 (5), 546-558 (2019).</li>
<li>Ram-Mohan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+chromatin+accessibility+responses+in+human+neutrophils+with+sensitive+pathogen+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Profiling chromatin accessibility responses in human neutrophils with sensitive pathogen detection.</a> Life Sci Alliance. 4 (8), e202000976(2021).</li>
<li>Wei, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+single-cell+rna-seq+and+atac-seq+data+across+treatment+time+points+in+pediatric+AML%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of single-cell rna-seq and atac-seq data across treatment time points in pediatric AML.</a> Blood. 136 (1), 29(2020).</li>
<li>Kolaczkowska, E., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophil+recruitment+and+function+in+health+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Neutrophil recruitment and function in health and inflammation.</a> Nat Rev Immunol. 13 (3), 159-175 (2013).</li>
<li>Pillay, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+labeling+with+2H20+reveals+a+human+neutrophil+lifespan+of+5.4+days%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vivo labeling with 2H20 reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days.</a> Blood. 116 (4), 625-627 (2010).</li>
<li>Orchard, P., Kyono, Y., Hensley, J., Kitzman, J. O., Parker, S. C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification%2C+dynamic+visualization%2C+and+validation+of+bias+in+ATAC-seq+data+with+ataqv%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Syst%22%5BJournal%5D)">Quantification, dynamic visualization, and validation of bias in ATAC-seq data with ataqv.</a> Cell Syst. 10 (3), 298-306.e4 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.4% トリパン ブルー</td><td>サイエンティフィック</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>1x リン酸緩衝生理食塩水</td><td>バイオシャープ</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>20 bp&ndash;5000 bp アライメントマーカー</td><td>バイオプティック</td><td>C109102-100A</td><td>DNA フラグメント分析装置 サポート製品</td></tr><tr><td>5k サイズマーカー(標準 50 bp ラダー)</td> <td>バイオプティック</td><td>C109101-100A</td><td>DNA フラグメント分析装置 サポート製品</td></tr><tr><td>アンプリコン精製ビーズ</td><td>ベックマン</td><td>A63881</td><td>アンプリコン精製ビーズは、高品質のDNA製品を得るための核酸精製キットです。</td></tr><tr><td>Anti-Ly6G MicroBeads Ultrapure, mouse</td><td>miltenyi</td><td>130-120-337</td><td>Anti-Ly-6G MicroBeads UltraPureマウスは、マウス骨髄の単一細胞懸濁液からマウス好中球を正の選択または枯渇させるために開発されました。</td></tr><tr><td>抗マウス CD11b-BV605 (1:200)</td><td>BD</td><td>Cat#563015</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス CD48-PE-Cy7 (1:400)</td><td>BD</td><td>Cat#560731</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス Ly6G-BV510 (1:200)</td><td>BD</td><td>Cat#740157</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J マウス、野生型、8週齢、オス</td><td>中国医学院実験動物科学研究所</td> 中国<td>医学院実験動物科学研究所科学</td><td></td></tr><tr><td>DNA分離バッファー</td><td>バイオプティック</td><td>C104406</td><td>DNAフラグメントアナライザー サポート製品</td></tr><tr><td>大腸菌由来の超高純度LPS(血清型0111:B4)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>Cat#L-2630</td><td></td></tr><tr><td>DNA定量試薬</td><td>vazyme</td><td>EQ111</td><td>DNA定量試薬は、シンプルで高感度で正確な二本鎖DNA(dsDNA)蛍光定量アッセイキットです。</td></tr><tr><td>赤血球溶解バッファー (10x)</td><td>BioLegend</td><td>Cat#420301</td><td></td></tr><tr><td>Fetal wevine serum</td><td>Gibco</td><td>Cat#10099141C</td><td></td></tr><tr><td>MS Separation columns</td><td>miltenyi</td><td>130-042-201</td><td>MS カラムは、細胞のポジティブセレクション用に設計されています。&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>S2 ゲル電気泳動針&nbsp;</td><td>バイオプティック</td><td>C105101</td><td>DNAフラグメントアナライザーサポート製品</td></tr><tr><td>手術器具:メス、解剖ハサミ、マイクロダイセクションハサミ、細かい鉗子、鈍い解剖鉗子、ニードルホルダー</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>https://www.fishersci.com/us/en/browse/90184247/surgical-tools</td><td>他の資格のあるサプライヤーから購入できます</td></tr><tr><td>シリンジ (1&nbsp;mL)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sterile-syringes-single-use-12/14955464</td><td>他の認定サプライヤーから購入可能</td></tr><tr><td>TruePrepTM DNAライブラリ調製キットV2 Illumina</td><td>vazyme</td><td>TD501-01</td>用 <td>TruePrep DNAライブラリ調製キットV2 Illumina用は、Illuminaのハイスループットシーケンシングプラットフォーム用に特別に開発された専用キットです。このキットを使用すると、DNAをIlluminaのハイスループットシーケンシングプラットフォーム専用のシーケンシングライブラリに調製できます。</td></tr><tr><td>TruePrepTM Index Kit V2 for Illumina</td><td>vazyme</td><td>TD202</td><td>TruePrep Index Kit V2 for Illuminaは、TruePrep DNAライブラリPrep Kit V2 for Illuminaのキットです。これは、96の異なるダブルエンドインデックスライブラリを準備するために使用できます。</td></tr></tbody></table>

マウス骨髄由来好中球のatac-seqライブラリー調製

ATAC-Seq Library Preparation of Murine Bone Marrow-Derived Neutrophils

概説されたプロトコルは、C57BL/6マウスの骨髄から好中球を単離し、ATAC-seqを介してリポ多糖(LPS)刺激前と後カマチンアクセシビリティのそれぞれの分散を比較するために採用されました。通常、生後6-8週齢のC57BL/6マウスの両大腿骨から2 x 107 BMCを採取し、その後、2-5 x 106 好中球を単離することができます。その中で、1 x 105 細胞をATAC-seqに使用し、余剰細胞を包括的な好中球解析に割り当てることができます。
FACSイムノフェノタイピングを採用して、免疫磁気選別後の好中球の純度と生存率を決定しました(図2)。前方散乱面積(FSC-A)と側方散乱面積(SSC-A)の分布だけで推定できるが、ここでは特定の好中球マーカー染色を用いてソーティング効果を実証した。FSC-AおよびSSC-Aゲーティングに続いて、FSC-Aおよび前方散乱高さ(FSC-H)を使用してセルをさらにゲーティングし、単一セルと凝集セルを区別しました。...

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

Assay for Transposase-Accessible Chromatin with sequencing (ATAC-seq) is a powerful, high-throughput technique for assessing chromatin accessibility and ...

atac-seq-library-preparation-of-murine-bone-marrow-derived-neutrophils

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、密度勾配遠心分離によりCellTrackerと染料を用いて好中球標識のマウス骨髄からの好中球の単離および精製のためのプロトコールを述べる。これは、下流の機能研究または養子移入と追跡実験の好中球の多数を取得するための、簡易で、迅速かつ再現性のある経済的な方法を表しています。...

機能研究のためのマウス骨髄好中球と養子移入実験の分離、精製とラベリング

この原稿は、in vitroおよびその注射後にマウスにおいて誘導される急性白血病に C1498細胞培養物を特徴付けるために使用することができる技術的手順を提供します。表現型および機能的分析は、フローサイトメトリー、免疫蛍光顕微鏡法、細胞化学およびメイグリュンワルドギムザ染色を使用して実行されます。...

マウスC1498細胞株およびその関連白血病マウスモデルを特徴付けるための詳細なプロトコル

高スループット シーケンス (seq ATAC) と相まってトランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイは、アクセス可能なクロマチンを明らかにするゲノム広い方法です。これは最終的な計算の分析は、人間のリンパ球 (Th1 ・ Th2) 用に最適化する分子からのステップバイ ステップ ATAC seq...

ATAC Seq による主なヒト T リンパ球のゲノム広いアクセス可能なクロマチンをマッピング

ここでは、解明in vitroとin vivoの分化のフィーダー フリー システムを使用して、マウスの NK 細胞の遺伝子サイレンシングを量産するためのプロトコルを提案する.

生体外でマウスのナチュラル キラー細胞の大量生産のため新規無料の送り装置システム

ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115...

大量の骨髄前駆細胞と新規セルソーティング戦略を使用してマウスの骨髄から樹状細胞前駆体の生成

ここでは、活性化 cd4 人間リンパ球を (ATAC seq) をシーケンス処理トランスポザーゼ アクセス クロマチンのアッセイを実行するプロトコルを提案します。プロトコルは、新しい換散バッファーの導入により 3% に 50% からミトコンドリア DNA...

主なヒト cd4 陽性 T リンパ球から低ミトコンドリア DNA 汚染 ATAC seq 試金

ここでは、好中球系統細胞の高次元質量細胞法(Time-Of-Flight、CyTOFによるサイトメトリー)分析のために、マウスまたはヒトから単離された新鮮な骨髄(BM)を処理するプロトコルを提示する。...

好中球系統細胞の質量細胞法解析に対する全骨髄の調製

この研究では、ラットの骨髄から豊富な好中球細胞外トラップ(NET)を単離するための2つの技術について概説しています。1 つの方法は、市販の好中球分離キットと密度勾配遠心分離を組み合わせたもので、もう 1...

同等の容量を持つラット骨髄好中球を単離するためのユニークなアプローチ

単一細胞/単一核のトランスクリプトミクスおよびマルチオミクスの成功は、細胞/核の品質に大きく依存します。したがって、組織からの細胞/核の分離とその精製は高度に標準化されなければなりません。このプロトコルは下流の単一核のmultiomeの試金のための頭脳および骨髄からの核の準備を記述する。...

単一核マルチオームアッセイのための高品質脳および骨髄核調製(英語)

ここでは、骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病のマウスモデルから骨髄微小環境集団を分離および特徴付けるための詳細なプロトコルが提示されます。この技術は、疾患の進行に伴う内皮細胞や間葉系間質細胞を含む非造血骨髄ニッチの変化を特定します。...

骨髄異形成症候群および急性骨髄性白血病における骨髄微小環境集団の同定

このプロトコルは、7-9日齢の新生児マウス骨髄細胞を単離し、L929細胞の上清を顆粒球コロニー刺激因子(M-CSF)の供給源として使用して分化したマクロファージを生成するための非酵素的で簡単な方法を説明しています。骨髄由来マクロファージは、表面抗原F4/80、CD206、CD11b、および機能的コンピテンシーについてさらに分析されました。...

新生児マウス骨髄単離と骨髄由来マクロファージの調製

学ぶマウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製法。免疫磁気分離で高純度を確保し、クロマチンアクセシビリティ解析を最適化します。免疫応答メカニズムの解明に役立ちます。

マウス骨髄由来好中球のATAC-Seqライブラリー調製

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