Name: 遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-02-13T11:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 42 s
Description: 学ぶ 遺伝子銃を用いた神経細胞の微粒子銃トランスフェクション法。ラット海馬スライス培養においてDNA被覆金粒子を用いて標的神経細胞を効率的に導入し、蛍光顕微鏡で個々の神経細胞を明瞭な背景で可視化する技術です。

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我々はこのビデオで紹介する全体海馬スライスの低倍率の画像を取得するとヘルプはマークルーカニックとHwai -ジョンチェンに感謝したいと思います。我々はまた、ビデオを伴うテキストと支援のためにサラパリッシュに感謝します。

微粒子銃トランスフェクション用プロトコール弾丸を作る弾丸は最大6ヶ月間の良いですが、2〜3ヶ月後にトランスフェクション効率に減少し始める可能性があります。弾丸は、乾燥剤のペレットの存在下で4℃で保存してください。常にバイアルを開く前に室温に暖かい弾丸が格納されるシンチレーションバイアルを、、てみましょう。 始める前には用意しておいてください。 <ul><li>スペルミジン（0.05M） </li><li>のCaCl 2（1M） </li><li>エタノール（100％ - ハイグレード - 未開封ボトル） </li><li>オートクレーブH 2 0 </li><li>トランスフェクトされるDNA </li><li>ポリビニルピロリドン（PVP - 20 mg / mlストック） </li><li> 2 X 15 mlコニカル（2/bulletセット） </li><li>チューブ（X〜30インチ/弾丸セット1にカット） </li><li>シンチレーションバイアル（1/bulletセット） </li><li>乾燥ペレット</li><li> 10ミリリットル注射器のw /エンドでのチューブ</li></ul>チューブを準備します。 <ol><li>ドライ〜20分の最小のチューブステーションW / N 2ガ ​​スの配管の30インチ（右O -リングを越えて延長約2インチ）（0.4気圧）。 </li></ol>金のビーズにDNAを沈殿させる。 <ol><li>マイクロ遠心チューブに50μmL総容積（最大50μgのトータルDNA）にトランスフェクトされるDNAを準備する</li><li>金の6-8 mgを秤量し、マイクロ遠心チューブに移す</li><li>金に0.05Mスペルミジンの100μLを加え20秒間超音波処理</li><li>ゴールド/スペルミジンするDNAの50μLを追加</li><li>渦（設定値の約5）W /キャップ開放</li><li> 1M CaCl 2の賢明な100μLをドロップ追加</li><li>短時間（&lt;5秒）を超音波で分解する</li><li>室温で10分間沈殿することができます</li><li>簡単に超音波処理</li></ol>超音波処理中にPVP溶液を調製します： <ol><li>弾丸のセットごとに15 mlコニカル、3.5mL希釈PVPのPVP溶液を希釈してください（3.5ミリリットル100パーセントエタノールに20mg/ml PVPの株式の7.5μLを加える） </li></ol> EtOHで金のビーズをすすぎ。 <ol><li>微量遠心機で10秒間フルスピードでの金のビーズをスピンダウン</li><li>上清を捨てますが、金のビーズの上に少量の液体を保持</li><li>必要に応じて1ミリリットルEtOHで3X洗って、、簡単にそれぞれの時間を超音波で分解する</li></ol> PVP溶液に再懸濁し、ゴールド/ DNA： <ol><li> 3.5ミリリットル希釈PVP / EtOH溶液200μLで金メダルペレットを再懸濁します</li><li>渦懸濁するために金ペレット（必要に応じて簡単に超音波処理） </li><li>新しい15 mLコニカルにゴールド/ PVP溶液200μLを転送する</li><li>すべての金を15 mLコニカルに転送されるまで一度PVP 200μLを加え、この方法で継続し、そして最終容量が3.2 mLである</li></ol>コー​​ティングチューブ： <ol><li>チューブの駅でN 2の電源を切り、乾燥させたチューブを取り外す</li><li> 10mlの注射器に乾燥チューブを取り付けます</li><li>精力的に金/ PVPで満たされた15 mLコニカルを振る</li><li>ゴールド/ PVP溶液中でチューブの端を置き、気泡に注意しながらゆっくりと吸い上げる</li><li>チューブの両端から〜2インチドライ残す</li><li>チューブはまだ注射器に接続されていると、金/ PVP溶液で満たされた、慎重にステーションに戻ってチューブを配置すると</li><li>解決策は、座っているチューブの端面をマーク</li><li>金が接続されている注射器で5分間解決しましょう</li><li>決済金が取り残されるように、シリンジを引いて、非常にゆっくりとソリューションを吸い取る（ウォッシュをバックアップしないことを確認してください） </li><li>シリンジを外します</li><li> 90 °回転させて、2秒放置</li><li> 180 °回転させて、別の2秒を座らせて</li><li> 5秒間チューブを回転させる</li><li>バルブが0.4の間に読むようにN 2をオンに- 0.5〜5分間乾燥しながら、金でコーティングされたチューブをスピン。 </li></ol>チューブを切断。 <ol><li>チューブの準備 - 駅からチューブを取り出して、マークに端をカット。 </li><li>カットカートリッジをキャッチするチューブチョッパーで標識されたシンチレーションバイアルに入れ</li><li>チューブチョッパーにチューブを配置し、清潔なカミソリでチューブをカット</li><li>シンチレーションバイアルに乾燥ペレットを配置</li><li> 4℃店舗カートリッジ° C </li></ol>組織切片を撮影する培養スライスを撮影するとき、それは汚染を避けるために比較的無菌テクニックを採用することが重要です。二つの異なる構造を撮影する場合、弾丸の両方のセットが同じカートリッジホルダーにロードすることができますが、バレルライナーと画面が構成要素との間で変更することを、覚えておいてください。 始める前には用意しておいてください。 <ul><li> DNAの弾丸（開く前に室温にシンチレーションバイアルを暖かくさせる） </li><li>組織切片</li><li>遺伝子銃をヘリオス</li><li>接続されている遺伝子銃のホースとヘリウムタンク&lt;/ LI&gt; <li>カートリッジのホルダー</li><li>代わりにプラスチック製のO -リング付きバレルライナー</li><li>ディフューザー（変更） </li><li>ディフューザーの画面</li><li>鉗子</li></ul>遺伝子銃を準備中。 <ol><li>使用して鉗子は、カートリッジホルダーにゴールドコーティングプラスチック製のカートリッジを置きます。 </li><li>最初のバックロックを押すことにより、遺伝子銃にカートリッジホルダーを配置</li><li>ロックとカートリッジホルダーを固定します</li><li> O -リングと場所でしっかりとディフューザーの画面でバレルライナーを取得する</li><li>遺伝子銃にバレルライナーをねじ込む</li></ol>遺伝子銃で培養スライスを撃つ： <ol><li>耳のマフを装着</li><li>ホース接続されているヘリウムガスのタンクへの遺伝子銃を差し込みます</li><li> 180 PSIにタンクに圧力を上げる</li><li>ディフューザーの画面からほこりやごみを除去するために空気中に空白を撃つ。銃を発射するには、最初のトリガを引くし、銃のビープ音がするまで、安全インターロックボタンを押し下げる。 </li><li>空白を撮影した後、インキュベーターからスライスを削除する</li><li>第一構築するために銃を進める</li><li>約0.5ディフューザーの画面で撮影する - スライスから1インチ</li><li>ウェル間のカートリッジを進める。 </li><li>最後の井戸を撮影した後、インキュベーターに戻してスライスを配置</li><li>ヘリウムホースからガンを取り外す前に、ガスと放出圧力をオフにする</li><li>ネジを外しバレルライナー、およびカートリッジを取り外し、使用するシェル</li></ol>カートリッジホルダーとバレルライナーのクリーニング： <ol><li>場所カートリッジ、バレルライナー、及び石鹸水でビーカーのディフューザーの画面</li><li> 20分間バスの超音波処理や超音波処理の場所のビーカー</li><li>すべての石鹸残基が除去されるまで、徹底的に水で洗い流してください</li><li>時間を70％エタノールに浸し</li><li>一晩乾燥させる乾燥したペーパータオルの上に置いて</li><li>クリーンカートリッジ、バレルライナー、および画面は、その後のバイオリスティックトランスフェクションに再利用することができます</li></ol>微粒子銃トランスフェクションのためのトラブルシューティングのヒント 微粒子銃トランスフェクションは、時々次善のトランスフェクションの条件になる可能性があります。それは少なすぎるか多すぎる細胞はトランスフェクション、高すぎるか低発現レベルにつながる可能性、または一般的には不健康になるために組織切片を引き起こす可能性があります。頻繁に不健康なスライスは、圧力の爆発に起因する。最適なトランスフェクションした組織切片を得るためのヒントです。 スライスが（またはあまりにも多くの細胞が/スライスをトランスフェクトしている場合）不健康なように表示される場合は、試してみてください。 <ul><li> 増加撮影距離</li><li>ガスのタンクで圧力の低下 </li><li>金の額を減少 </li><li> Bio - Rad社のディフューザーの中央を切断し、ディフューザーの画面で中央に置き換える。 </li></ul> 少なすぎるの細胞がトランスフェクトされている場合、試してみてください。 <ul><li>撮影距離を減少させる </li><li>ガスのタンクで圧力の上昇 </li><li>金の額を増加 </li><li> /ウェルの組織スライスの数を増加 </li><li>バレルライナーのO -リングが完全であることを確認してください。 </li></ul>あなたが同じ撮影を確認中にトランスフェクトされた両方の数が多すぎると細胞数が少なすぎるとスライスを取得する場合： <ul><li>あなたは対称的に、上記も銃を保持している</li><li>その金は、均等にコーティングチューブの内側です。 （あなたが金のラインを取得する場合、金が定着した後で速い速度でチューブから上清を引き出すと窒素の電源を入れる前に、金の長い回転させる。一方、あなたが金のストリーキングを取得している場合、 、この可能性が高い弾丸の生成時にあまりにも多くの水分への暴露によるものです：チューブは塗装前に完全に乾いていることを、あなたがエタノールの未開封の瓶を使用していることを確認し、）あなたがふたをキャッピングし、適時に弾丸を準備している。 </li></ul>トランスフェクション効率が最適と思われる場合は（＃細胞が/スライスをトランスフェクト）が、発現レベルが高すぎるまたは低すぎるようだ。 <ul><li>金に比率のDNAを調整してください。 （それが低すぎる場合、例えば、金の量を維持するが、DNAの量を増やす 。） </li><li>撮影とデータ収集間の時間の量を調整する</li></ul>あなたの構成のいずれかの少なすぎる表現を取得する場合二重トランスフェクションの場合には、、適切な方法で2つの構成要素の比率を調整し、両方の構造が同じプロモーター下にあることを確認して、あのことを確認するようにプロモーターは、他の域外競合しません。

<ol><li>Klein, T. M., Fromm, M., Weissinger, A., Tomes, D., Schaaf, S., Sletten, M., Sanford, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+of+foreign+genes+into+intact+maize+cells+with+high-velocity+microprojectiles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Transfer of foreign genes into intact maize cells with high-velocity microprojectiles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85, 4305-4309 (1988).</li>
<li>Wellmann, H., Kaltschmidt, B., Kaltschmidt, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+protocol+for+biolistic+transfection+of+brain+slices+and+dissociated+cultured+neurons+with+a+hand-held+gene+gun%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimized protocol for biolistic transfection of brain slices and dissociated cultured neurons with a hand-held gene gun.</a> J. Neurosci. Methods. 92, 55-64 (1999).</li>
<li>McAllister, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transfection+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+STKE%22%5BJournal%5D)">Biolistic transfection of neurons.</a> Sci. STKE. 51, 1-13 (2000).</li>
<li>Svoboda, K., Yasuda, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+two-photon+excitation+microscopy+and+its+applications+to+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience.</a> Neuron. 50, 823-839 (2006).</li>
</ol>

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆した金粒子による生体組織の砲撃を経由して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。弾丸が核内に静止する時、粒子による遺伝子導入では、一般的なトランスフェクションされた細胞になる。多くの異なるトランスフェクション法が存在するが、そのようなマイクロインジェクション、リポフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーションおよびウイルス性トランスフェクションとして、バイオリスティックトランスフェクションは簡単にこれらの他の方法を用いてトランスフェクトしていない細胞をトランスフェクトするための集中的な少ない労働力、および効率的な代替手段を提供することができます。細胞壁の存在は、既存の方法1を使用してトランスフェクションが困難になるので、実際には、まず、植物に遺伝子導入する技術として開発されました。有糸分裂後のニューロンは2,3をトランスフェクションが難しいことで知られていますので、同様に、biolisticsは神経生物学の分野で人気を博している。特に、それは広く無傷の脳スライス内の単一ニューロンの微細な形態を評価することを目的とした実験に使用される原理の手法として認識されます。方法は、遺伝子銃保有の手を（; Bio - Rad社ヘリオス遺伝子銃システム）を使用して培養脳スライスの微粒子銃トランスフェクションを実行する方法の詳細かつ包括的な説明を提供するここで説明する。 それは脳スライス中の細胞の疎な数のトランスフェクションを可能にするため微粒子銃トランスフェクションは、スライス培養で神経細胞をトランスフェクションするための好ましい方法となっています。この方法では、個々の神経細胞は単独で調べることができます。この技術は特によく脳スライスの神経細胞のトランスフェクションに適しているため、それはしばしば、2光子顕微鏡と組み合わせて使用されている、2光子励起以来、光散乱の組織4内の深い蛍光標識細胞の可視化を可能にします。確かにこの映像を通して紹介単錐体細胞の高倍率の画像は、カスタム構築された2光子レーザー走査顕微鏡を用いて捕獲された。結論微粒子銃トランスフェクションでは周囲の細胞の高密度のコンテキスト内で個々の細胞にトランスフェクションの効率的な手段であり、そのように蛍光神経スライス培養で個々のニューロンを標識するための非常に役立っています。

我々は個別にすべての製品をリストアップしたものの、それは、BIO - RAD（猫＃165から2431まで）上記のすべての製品に含まれる、&quot;遺伝子銃システムヘリオス&quot;を購入するより経済的です。

遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備

Preparation of Gene Gun Bullets and Biolistic Transfection of Neurons in Slice Culture

微粒子銃トランスフェクションは、高速のDNA被覆粒子と組織を照射して細胞をトランスフェクトの物理的な手段です。我々はDNAコーティングされた弾丸の初期準備から遺伝子銃を用いて器官切片培養の最後の撮影に、ラット海馬スライスの微粒子銃トランスフェクションのための詳細なプロトコルを提供しています。遺伝子銃のトランスフェクションは、神経細胞をトランスフェクトの効率的かつ容易な手段であると蛍光組織切片中の細胞の小さなサブセットを標識するために特に便利です。このビデオでは、まず、DNAで被覆金粒子に必要なステップを概説。我々は、次のゴールド/ DNA銃弾のプラスチックチューブの内側を並べる方法を示し、および遺伝子銃にロードするためのプラスチック製のカートリッジを取得するために、このチューブをカットする方法。最後に、我々は、遺伝子銃をヘリオス、そして健康的で最適にトランスフェクトされた組織切片を得るためにトラブルシューティングのアドバイスを提供するバイオラッドの処理を示す、ラット海馬スライス培養のバイオリスティックトランスフェクションを実行します。

我々は、DNAコートした金の弾丸の製造方法を説明し、biolistically培養海馬スライスの神経細胞をトランスフェクトするためにそのような弾丸の使用方法を示しています。

バイオリスティック法によるトランスフェクションは、DNAをコーティングした粒子を高速で組織に衝突させることにより、細胞に遺伝子を導入する物理的な手法です。本ビデオでは、詳細な...

バイオリスティック法（ジーンガン法）によるトランスフェクションは、DNAをコーティングした粒子を高速度で組織に衝突させることで細胞に導入する物理的な手法です。この技術はニューロンへの導入において効率的かつ簡便な手段であり、特に組織切片内の少数の細胞のみに導入したい場合に有用です。例えば、蛍光顕微鏡を用いて、完全な切片内でのニューロンの形態を調べる研究などに適用されます。Bicトランスフェクションにより、非導入細胞というクリーンな背景の中で個々のニューロンを可視化することが可能になります。本ビデオでは、DNAコーティングしたジーンガン用粒子を調製し、器官培養海馬スライスにおいてBicトランスフェクションを行う方法を実演します。ジョージア・ウッズです。私はカリフォルニア大学デービス校のKaren Zito博士の研究室に所属する大学院生です。本日は、DNAでコーティングしたブレットの作製方法と、ラット海馬切片へのBicトランスフェクションの実施方法を実演します。Bicトランスフェクションの基本的な手順は、まずゴールド粒子を導入したいDNAでコーティングし、次にプラスチックチューブの内側をこのゴールド粒子でコーティングすることです。チューブをカートリッジ状に切り分け、ジーンガンに装填し、導入したい組織にショットします。それでは、始めていきましょう。導入を行う前に、まずDNAをコーティングした粒子を準備する必要があります。これは、導入するDNAプラスミドを1.6 µmの金粒子にコーティングすることを意味します。ショットduring中、個々の金粒子が弾丸として機能して細胞内に浸入し、形質導入が行われます。そこでまず、導入するためのDNAを準備する必要があります。理想的には、50 µLの水で調整した1セットのバレットあたり、50 µg未満のDNAを使用します。なお、使用するDNAの正確な量は、最適な発現レベルが得られるように、各コンストラクトに対して経験的に決定する必要があることに留意してください。DNAの分注が完了したので、次にゴールドビーズに精子を添加します。あらかじめ計量した8 mgの金に、100 µLの精子懸濁液を加え、約20秒間ソニケーションを行う。これは精子である。MEINEはポリアミンであり、金リードを正に帯電させることで、負に帯電したDNAを正に帯電した金属に相互作用させます。22秒後、50 µLのDNA水溶液を金に加えます。ビーズにDNAを添加した後、100 µLの塩化カルシウムを滴下しながらボルテックスします。塩化カルシウムによりDNAが沈殿します。短時間ボルテックスした後、溶液を10分間静置して沈殿させます。10分間の沈殿後、卓上遠心機を用いてDNAと金を最高速度で30秒間遠心分離します。最高速度での遠心後、金ペレットを吸い込まないように注意しながら、上清の大部分をピペットで除去します。この段階で、金に沈殿しなかった不要なDNAを除去しています。その後、金粒子を1 mLの新鮮なエタノールで洗浄し、短時間超音波処理します。DNAが沈殿すると、金粒子が凝集しやすくなります。軽い超音波処理を行うことで、これらの金粒子の凝集を解消します。ただし、過剰な超音波処理によってDNAが断片化されないよう注意してください。金ペレットを再度遠心分離し、ピペッティングでエタノールを除去します。エタノールによる洗浄をさらに2回繰り返します。3回目のエタノール洗浄後、200 µLの希釈ポリビニルピロロン（PVP）溶液を加え、超音波処理を行います。コーティングされた金を、200 µLの希釈PVP溶液が入った15 milコニカルチューブに速やかに移します。PVPは、金粒子を使用するプラスチックチューブに付着させるための溶媒です。次のステップでは、エピチューブに200 µLのPVPを加えることで、チューブ内に残っている金ビーズの痕跡を除去します。その後、短時間的に攪拌し、15 mlコニカルチューブへ移します。すべての金が15 mlコニカルチューブに移されるまで、この操作を繰り返します。残りのPVP溶液を移し、金が3.2 mlのPVPエタノール溶液に再懸濁された状態にします。次に、ジーンガンに装填される際に弾丸を保持するためのプラスチックチューブのコーティングを行います。金粒子にDNAがコーティングされたので、プラスチックチューブの内側にこれらの金粒子をライニングする必要があります。この金コーティングされたプラスチックチューブを、実際にジーンガンのチューブに装填します。まず、チューブをOリングから約2インチ突き出るように切断します。チューブをチューブ調製ステーションにセットしたら、流量計の数値が約0.4になるように圧力バルブを回します。窒素によりチューブを乾燥させるための無水雰囲気を提供するため、チューブを約20分間乾燥させます。この乾燥工程は、前のステップで示したDNAによる金弾丸のコーティングを行うのと同時に実施するのが最適です。そうすることで、コーティングが完了した時点でチューブが乾燥しており、すぐに次の工程へ進むことができます。チューブの乾燥と金へのDNAコーティングが完了したため、金ビーズの調製を行います。金PVP溶液をチューブに満たす前に、N2ステーションの電源を切ります。乾燥したチューブをステーションから取り外し、10 milシリンジに取り付けてから、PVPと金をチューブの中に吸い上げます。溶液を十分に振って混ぜ合わせ、気泡が入らないように注意しながら、直ちに乾燥したチューブの中に吸い上げます。また、溶液をシリンジの中まで吸い込まないように注意してください。チューブ内にPVP Gold溶液を満たしたら、慎重にチューブをN twoステーションに戻します。金粒子がチューブの底に沈殿するように、シリンジを装着したまま5分間静置します。溶液が沈殿したチューブの端に印を付けます。溶液が静止すると、付属のシリンジを用いてチューブの底に金の筋が見えるようになります。逆流させないように注意しながら、上澄み液を非常にゆっくりと吸引してください。次に、チューブ内部に金を均一に付着させるため、チューブを回転させて乾燥させます。まず、チューブを90度回転させます。2秒間静置してください。次に、さらに180度回転させ、もう一度2秒間静置します。5秒間回転させ、最後にN2をオンにして、ステーションの数値が0.4から0.5の間になるように調整し、チューブを乾燥させながら5分間スピンさせます。5分が経過し、金粒子が乾燥したので、チューブをジーンガンにロード可能なカートリッジ状に切断する必要があります。ここで、ジーンガンのシリンダーにロードするのに適切なサイズのシェルを作成するため、チューブを約0.5インチのセクションに切断します。シェルを回収するために、シミュレーション胆汁をカッターの下に配置し、マークに合わせてチューブをカットします。清潔なカミソリを使用してチューブを切断してください。チューブをチューブチョッパーに入れ、適切な長さにカットします。抵抗を感じるまでチューブを前方に送り、その後切断してください。チューブをカットしてシンチレーションバイアルに回収した後、乾燥剤ペレットをシンチレーションバイアルに入れます。保存したサンプルは最大6ヶ月間有効ですが、2〜3ヶ月経過するとトランスフェクション効率が低下し始める可能性があります。そのため、バイアルにコンストラクト名と日付を記載しておくことが推奨されます。バレットは作製後すぐに使用するか、4°Cで保存してください。4°Cで保存したバレットを使用する場合は、バレットが水分を吸収するのを防ぐため、開封前にバイアルを室温で約15分間温めてください。これで、遺伝子銃を用いてDNAバレットを打ち込む準備が整いました。弾丸（粒子）の作製が完了したので、実際に細胞へトランスフェクションを行います。BioRad Helios 遺伝子銃を使用し、摘出後5日間培養したラット海馬切片に射撃します。遺伝子銃はヘリウムガスタンクに接続して使用します。ガンが発射されると、タンクからの短時間の圧力パルスによって、スライス上の金粒子が加速されます。一般的に、金粒子が細胞核に組み込まれた場合、その細胞はトランスフェクションされます。培養スライスを用いて電導入を行うため、コンタミネーションを避けるためにBicトランスフェクションの全工程において比較的無菌的な手法を用います。カートリッジが室温まで温まったら、シミュレーションバイアルを開け、金コーティングされたプラスチックカートリッジをカートリッジホルダーにセットします。次に、シリンダーロックを押し戻してから、カートリッジホルダーをジーンガンに装着します。次に、バレルライナーをガンに取り付ける必要があります。まず、Oリングがバレルライナーに装着されており、ディフューザースクリーンが固定されていることを確認してください。このスクリーンはバレルからの圧力を分散させる役割を果たし、金を噴霧させることで、ウェル内により均一に金を分散させることができます。バレルライナーをジーンガンに最後までねじ込みます。2種類の異なる構築物を導入する場合、両方の弾丸セットを同じカートリッジホルダーに装填できますが、構築物を変えるごとにバレルライナーとスクリーンを交換してください。これでジーンガンをヘリウム源に取り付ける準備が整いました。ジーンガンをヘリウムガスタンクに接続されたホースに差し込みます。カチッと音がして固定されたら、タンクの圧力を180 PSIまで上げます。これで射撃準備が整いましたが、まず耳栓などの聴覚保護具を着用してください。また、ディフューザースクリーンからほこりや破片を取り除くため、空打ちを行ってください。まず、ガンがビープ音を鳴らすまでセーフティインターロックボタンを押し、トリガーを引きます。これでスライスの照射準備が完了しました。ブランクショットを行った後、インキュベーターからスライスを取り出します。海馬の解剖時、1ウェルあたり4枚のスライスを配置し、メンブレンの中央付近に2 cm四方の正方形の角を形成するように並べます。ディフューザースクリーンをスライスから約0.5〜1インチ離した状態で、各ウェルに照射します。導入した細胞は、通常、コンストラクトに応じて1〜5日以内に観察可能です。すべてのウェルの撮影が完了したら、ガスの供給を止め、圧力を開放してから、ガンをヘリウムホースから取り外します。カートリッジと使用済みのシェルを取り除きます。バレルライナーを緩めて取り外します。カートリッジ、バレルライナー、スクリーンは、石鹸水に浸して20分間超音波洗浄し、水で十分にすすいだ後、70%ethanolに1時間浸漬し、その後、吸水ペーパーの上に置いて一晩乾燥させることで洗浄できます。洗浄したカートリッジとスクリーンは、その後の生物学的トランスフェクションで再利用可能です。それでは、いくつかのトランスフェクション結果を見てみましょう。標準的な海馬スライス標本であっても、使用する弾丸やスライスによって、トランスフェクション効率にはかなり幅が出ることがあります。一般的に、適切に単離された形質導入ニューロンを得るためには、形質導入効率が比較的低いことが望ましい。また、過剰に多くの細胞に形質導入されると、最適な条件下であってもスライスの全体的な健康状態が悪化する。通常、1スライスあたり20細胞未満となるが、同じウェル内の他のスライスでは、より多くの細胞が形質導入されることが多い。トランスフェクションを実施したスライスおよびその他のスライスでは、細胞数が減少します。スライス間でのトランスフェクション効率の不一致は、通常、バレルに対するスライスの配置が対称でなかったか、あるいは金粒子がチューブ周囲に均一にコーティングされず、片側に集中していたことが原因です。トランスフェクションされた細胞が多すぎる場合は、サンプルからの射出距離を長くするか、射出圧力を下げるか、あるいは弾丸作成に使用する金の量を減らしてください。ここでは、形質導入されたCA1錐体ニューロンの優れた例をご覧いただけます。この特定の細胞には、細胞内に埋め込まれたゴールドブレットが確認できます。こちらが形質導入されたニューロンの拡大図です。CA1において、刺激（Shooting）は時にスライスの状態を悪化させることがあります。圧力噴射によって、不健全なスライスが形成されることがよくあります。Heliosジーンガンシステムには、中心に金属十字があるディフューザーが付属しています。我々は内部の金属十字を切り取り、代わりに金属スクリーンを使用しています。スクリーンをバレルライナーの端よりもわずかに大きく切り、バレルライナーの端と切断したディフューザーの間に挟み込みます。これにより、スライスの状態が改善されることが分かりました。さらに、最適な射出条件は実験準備によって異なるため、異なる実験準備に合わせて最適化するには、ヘリウムタンクの圧力とサンプルからの射出距離を調整してください。最後に、デュアルトランスフェクションのために2つの異なる構築物を含む粒子をコートしたい場合は、両方の構築物が同じプロモーターの下にあることを確認してください。そうすることで、一方のプロモーターがもう一方を凌駕することを防げます。以上で、ジーンガン用粒子の調製方法と、BICトランスフェクションを用いた海馬スライスへのトランスフェクション方法について説明しました。これは、個別にイメージング可能な単一ニューロンの形態学的研究を行うための非常に強力な手法です。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験がうまくいくことを願っております。

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出典: Denaxa, M., el al., Transplantation of Chemogenetically Engineered Cortical Interneuron Progenitors into Early Postnatal Mouse Brains.J. Vis. 経験。...

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器官型脳スライス調製物の最近の改善により、バイオテクノロジーへの応用が可能になりました。器官型スライスは、機能的なシナプス結合を含むin...

位置選択的微粒子銃は、改変された遺伝子銃を使用した器官型脳切片におけるターゲティング

ここで提示される単細胞エレクトロポレーションのためのプロトコルは、体外海馬スライス培養年代の範囲にわたって興奮性および阻害性ニューロンの両方の遺伝子を送達することができる。このアプローチは、細胞自律機能や細胞間機能を調べるために使用できる個々の細胞内の遺伝子の正確かつ効率的な発現を提供します。...

マウス海馬興奮性およびクラス特異的阻害ニューロンの異なるorganotypics Slice培養における単細胞エレクトロポレーション

学ぶ 遺伝子銃を用いた神経細胞の微粒子銃トランスフェクション法。ラット海馬スライス培養においてDNA被覆金粒子を用いて標的神経細胞を効率的に導入し、蛍光顕微鏡で個々の神経細胞を明瞭な背景で可視化する技術です。

遺伝子銃の箇条書きとスライス培養における神経細胞の微粒子銃トランスフェクションの準備

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