Name: Perls/DAB Stainingによる5xFADマウスの脳内における鉄沈着の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T12:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: 学ぶ Perls/DAB染色法による5xFADマウス脳内鉄沈着の定量的評価。アルツハイマー病モデルにおける海馬と大脳皮質の鉄蓄積を検出し、病理メカニズムの解明に活用できます。

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<li>Hill, J. M., Switzer, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regional+distribution+and+cellular+localization+of+iron+in+the+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The regional distribution and cellular localization of iron in the rat brain.</a> Neuroscience. 11 (3), 595-603 (1984).</li>
<li>Meguro, R., Asano, Y., Iwatsuki, H., Shoumura, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion-perls+and+-turnbull+methods+supplemented+by+dab+intensification+for+nonheme+iron+histochemistry%3A+Demonstration+of+the+superior+sensitivity+of+the+methods+in+the+liver%2C+spleen%2C+and+stomach+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Perfusion-perls and -turnbull methods supplemented by dab intensification for nonheme iron histochemistry: Demonstration of the superior sensitivity of the methods in the liver, spleen, and stomach of the rat.</a> Histochem Cell Biol. 120 (1), 73-82 (2003).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((S-nitrosylation+of+divalent+metal+transporter+1+enhances+iron+uptake+to+mediate+loss+of+dopaminergic+neurons+and+motoric+deficit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">S-nitrosylation of divalent metal transporter 1 enhances iron uptake to mediate loss of dopaminergic neurons and motoric deficit.</a> J Neurosci. 38 (39), 8364-8377 (2018).</li>
<li>Guillemot, J., Canuel, M., Essalmani, R., Prat, A., Seidah, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implication+of+the+proprotein+convertases+in+iron+homeostasis%3A+Proprotein+convertase+7+sheds+human+transferrin+receptor+1+and+furin+activates+hepcidin%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Implication of the proprotein convertases in iron homeostasis: Proprotein convertase 7 sheds human transferrin receptor 1 and furin activates hepcidin.</a> Hepatology. 57 (6), 2514-2524 (2013).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferritin+light+chain+interacts+with+pen-2+and+affects+%CE%B3-secretase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Ferritin light chain interacts with pen-2 and affects γ-secretase activity.</a> Neurosci Lett. 548, 90-94 (2013).</li>
<li>Jin Jung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+stress+induces+inactivation+of+protein+phosphatase+2a%2C+promoting+proinflammatory+nf-%CE%BAb+in+aged+rat+kidney%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Oxidative stress induces inactivation of protein phosphatase 2a, promoting proinflammatory nf-κb in aged rat kidney.</a> Free Radic Biol Med. 61, 206-217 (2013).</li>
<li>Connor, J. R., Menzies, S. L., Martin, S. M. S., Mufson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+distribution+of+transferrin%2C+ferritin%2C+and+iron+in+normal+and+aged+human+brains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular distribution of transferrin, ferritin, and iron in normal and aged human brains.</a> J Neurosci Res. 27 (4), 595-611 (2004).</li>
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アルツハイマー病(AD)は、最も一般的な神経変性疾患であり、社会にとって深刻な問題となっています。ADの有病率は、1,2,3,4歳とともに劇的に増加します。アルツハイマー病(AD)の主な病理学的特徴には、タウタンパク質の異常なリン酸化によるβ-アミロイド(Aβ)プラークと神経原線維変化(NFT)の沈着が含まれます。Aβは、β-セクレターゼおよびγ-セクレターゼ酵素によるアミロイド前駆体タンパク質(APP)の連続的な切断によって生成されます。Aβの産生やクリアランスの調節不全は、脳内に蓄積し、アミロイド斑を形成することで、アミロイド斑が形成されます。これは、アミロイドの最も初期の病理学的マーカーの1つとして認識されています。これらのプラークは、直接的なニューロンの損傷を引き起こすだけでなく、神経炎症、酸化ストレス、シナプス機能障害などの有害な影響の連鎖を引き起こします。全体として、これらのプロセスは、ニューロンの死とAD5で観察される進行性の認知機能低下に寄与しています。アミロイドβプラーク沈着や過剰リン酸化タウタンパク質凝集など、主にアルツハイマー病(AD)の病理学的特徴を標的とした数十年にわたる研究にもかかわらず、臨床的に意味のある治療上のブレークスルーは依然としてとらえどころがなく、既存の介入では疾患の進行を修飾する効果が限定的であることが示されています6。
鉄は脳の機能を維持するための重要な金属であり、酸素輸送、DNA合成、ミトコンドリア呼吸、ミエリン合成、神経伝達物質合成、代謝に関与しています。しかし、鉄は、濃度が細胞隔離の能力を超えると有害になる6,7,8。鉄沈着の増加は、通常はAβプラークと共局在し、AD9,10の患者の脳の皮質領域と海馬領域の両方で観察されています。フェントン反応11を通じて、細胞内の遊離鉄は、活性酸素種だけでなく、ヒドロキシルラジカル(•OH)を生成することができます。これらの有害物質は、グリア細胞を活性化して神経炎症を誘発するだけでなく、酸化ストレスを通じて細胞の生体分子を攻撃し、正常な細胞機能を混乱させ、シナプス機能障害を引き起こします8,12。さらに、鉄の増加はADの病理学的徴候の発症に直接関与しており、鉄はAβ産生に寄与し12、またタウタンパク質の機能障害を増加させ、神経原線維変化13を引き起こす。
脳内の鉄含有量を評価するために、磁気共鳴画像法(MRI)、化学的および組織化学的方法など、いくつかの技術が開発されてきた14。MRIを用いた脳内鉄濃度の in vivo 定量化は、老化および神経変性患者にとって臨床的に重要である15。MRIは、非侵襲的で高感度であるという利点があり、病気の初期段階で鉄の沈着を検出できます。特に、磁場依存性R2増加(FDRI)技術は、フェリチン鉄とヘム鉄16のような鉄の異なる形態を区別することができる。しかし、MRIは細胞レベルで鉄の蓄積を検出することができず、高価なため、主に臨床研究で使用されています17。
比色測定は、物質(鉄など)の濃度を、溶液中の物質と発色剤18との反応によって生成される色の強度を測定することによって決定する化学的方法である。この方法は簡単に実行でき、低コストの試薬と機器を使用するため、予算が限られているラボに適しています18。しかし、この方法の精度と感度は、環境要因、発色時間、およびオペレーターの主観的な判断によって結果が影響を受けるため、非常に限られています。フレーム原子吸光分析(FAAS)は、鉄のレベル19を評価するために使用できる別の方法です。この方法では、目的の組織を高温炉で燃焼させることにより、清澄化されたサンプル溶液が得られます。次に、サンプルを塩酸を使用して溶解し、溶液中の鉄の濃度を原子吸光分析 法で 測定します。この方法は感度が高く、すべてのタイプの生物学的サンプルに適しています19。しかし、このプロセスには時間がかかり、高価な機器が必要なため、その使用は限られています。
非ヘム第二鉄を検出するためのPerls'/DAB染色は、他の組織化学的方法と比較して高い特異性と実装の容易さから、最も一般的に使用される鉄検出法です14。比色分析とは異なり、Perls染色は、鉄イオンとフェロシアン化カリウムとの反応に依存して青色の沈殿物を生成する定性的な組織化学的染色法です。これは、組織内の鉄の存在と分布を顕微鏡で視覚化するために使用されます。さらに、この方法により、異なる細胞タイプでの鉄沈着を区別し、鉄沈着の細胞内分布を観察することができ、AD20の研究方法を提供します。パールズ染色は主に非ヘム第二鉄を検出し、プルシアンブルー錯体の形成に依存します。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67501/67501eq01.jpg" style="margin: auto;">
(プルシアンブルー)
しかし、従来のPerls染色は、低鉄レベルでの鉄局在を検出するのに効果がありません。ジアミノベンジジン(DAB)を添加すると、ヘキサシアノ鉄と反応して褐色の化合物を形成し、アッセイの特異性を高めます21。
このプロトコルの目標は、ADマウスモデルの脳内の鉄沈着量と分布を評価する方法を説明することです。このプロトコルでは、生後8か月の5×FAD(C57BL/6J)トランスジェニックマウスをADマウスモデルとして使用し、同齢の野生型マウスと比較しました。ここでは、化学試薬の調製、脳の切片化、Perls/DAB染色の実施、染色後に撮影した画像の解析の手順について詳しく説明します。

<table><tbody><tr><td>0.1 M PBS</td><td>バイオシャープ</td><td>BL601A</td><td>脱イオン水を加えて溶液</td></tr><tr><td>4% PFA&nbsp;</td><td>Beyotime</td><td>P0099</td><td>4 >C 用</td></tr><tr><td>20X DAB 溶液</td><td>Bioss</td><td>C-0003</td><td>Mix 10 &mu;l ソリューション A, 10 &mu;l ソリューション B と 180 &mu;l PBS</td></tr><tr><td>アルコール</td><td>Supelco</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Sigma</td><td>7647-01-0</td> 蒸留<td>水を50 ml</td></tr><tr><td>ケタミンに加える&nbsp;</td><td>麻酔</td><td></td>顕微鏡オリンパスCX43<td></td>のための中国国立医薬品H20193336 100 mg / kg</tr>最適な<tr><td>切断温度化合物(OCT)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>カリウムフェロシニド溶液</td><td>シグマ</td><td>14038-43-8</td><td>50mlス</td></tr><tr><td>クロー</td>ス<td>シグマ</td><td>57-50-1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td>キシラジン&に蒸留水を追加します<td></td></tr><tr><td>nbsp;</td><td>Y-S バイオテクノロジー</td><td>YS-(BC)-2842</td><td>麻酔用 15 mg/kg</td></tr><tr><td>キシレン Σ</td><td></td><td>1330-20-7</td><td></td></tr></tbody></table>

perls/dab stainingによる5xfadマウスの脳内における鉄沈着の評価

Assessing Iron Deposition in the Brains of 5xFAD Mice by Perls'/DAB Staining

ADモデルマウスにおける鉄の分布と蓄積を調べるために、生後8ヶ月齢の5xFADマウスの矢状切片にPerls/DAB染色を行いました。図3に示すように、Perls/DAB染色シグナルは、生後8ヶ月の5xFADマウスと野生型マウス、および生後2ヶ月の野生型マウスで観察されました。5xFADマウスでは、海馬と皮質、特に海馬の亜細胞で高いPerls'/DAB染色シグナルが観察されました。野生型マウスは、検証されたネガティブコントロールとして機能しました。生後2か月と8か月のコホートの両方で、鉄沈着シグナルが有意に減衰し(図3A)、検出可能ではあるが有意ではない年齢進行性の蓄積傾向が示されました。40×倍率で、5xFADマウスのシグナルはAβプラーク様構造で観察され、これは以前の研究9,10(図3B)と一致した。4×倍率の画像をつなぎ合わせて、5xFAD...

Perls/DAB Stainingによる5xFADマウスの脳内における鉄沈着の評価

Alzheimer's disease (AD), a common neurodegenerative disease, is the leading cause of dementia in the elderly. Iron deposition is closely linked to the ...

assessing-iron-deposition-brains-5xfad-mice-perls-dab

Research

JoVE Journal

Neuroscience

神経科学

ADの病理学的特徴の一つは、アミロイドβ蛋白質の正の神経突起斑の形成である。...

アルツハイマー病のマウスモデルにおける神経突起斑の検出

出典:Mukherjee, K., et.al. シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡を用いた脳ミトコンドリアの解析 J. Vis. Exp. (2016)このビデオは、その準備を示しています。...

シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡による神経細胞ミトコンドリアのイメージング

この原稿が縦2光子顕微鏡を用いたin vivoでのアミロイド斑の蓄積の間に脳血管系のリモデリングを追跡するための手順を説明します。間引き頭蓋骨製剤は、アルツハイマー病のマウスモデルにおける脳損傷の進行を評価するために、蛍光色素の可視化を可能にします。...

縦<em&gt;インビボ</em&gt;脳血管系のイメージング：中枢神経系疾患との関連

定量的にレーザアブレーションによって組織に金属をマッピングする - 誘導結合プラズマ - 質量分析法（LA-ICP-MS）は、金属が正常な機能と疾患過程に関与どのように新たな洞察を提供することができます敏感な分析技術です。ここでは、定量的にマウス神経組織の薄い部分に金属を画像化するためのプロトコルについて説明します。...

誘導結合プラズマ -   - レーザーアブレーションによる脳組織におけるイメージング金属質量分析法（LA-ICP-MS）

本研究では神経変性条件下で血液-脳関門の破壊を評価するための簡単で効率的な手順を提案する.我々 の目的を達成するために我々 は高分子量かにラベル (FITC)...

神経変性疾患のマウスモデルで FITC 標識アルブミンの点滴静注による血液脳関門透過性の評価

このプロトコルは、灌流、脳切片、自由浮遊免疫染色、組織実装、イメージングを含むマウス脳組織学的研究のための効率的で再現可能なアプローチを記述する。...

マウス脳のフリーフローティング免疫染色

この記事では、マウス妊娠中の鉄輸送の研究のために、トランスフェリン結合非放射性同位体鉄を調製および投与する方法を示します。胎児胎盤区画中の同位体鉄を定量するためのアプローチも記載されている。...

非放射性鉄同位体を用いたマウス胎盤 を 横切る鉄輸送の定量

ここでは、動物組織中の非ヘム鉄含有量を測定するためのプロトコルが、ほとんどの実験室で容易に実施できる単純で十分に確立された比色アッセイを使用して提供される。...

バソフェナントロリンベースの比色アッセイを用いた組織非ヘム鉄含有量の測定

本プロトコールは、アルツハイマー病のAPP/PS1トランスジェニックマウスモデルにおけるアミロイドβ負荷を定量するために、矢状マウス脳切片の全領域またはサブ領域の関心分析を実行する手順を記載および比較する。...

マウス脳切片におけるアミロイドβ負荷の完全領域対小領域定量化

マウスにおける上行性膣感染症、早産、および新生児罹患率のモデル化

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