Name: CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T12:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: 学ぶ CRISPR/Cas9とCCK-8アッセイを併用した造血幹細胞・前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の同定法。白血病発がん機構の解明と新規治療標的の探索に応用可能です。

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<ol><li>Wilkinson, A. C., Igarashi, K. J., Nakauchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haematopoietic+stem+cell+self-renewal+in+vivo+and+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Haematopoietic stem cell self-renewal in vivo and ex vivo.</a> Nat Rev Genet. 21 (9), 541-554 (2020).</li>
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<li>Cai, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genome-wide+long+noncoding+RNA+CRISPRi+screen+identifies+PRANCR+as+a+novel+regulator+of+epidermal+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A genome-wide long noncoding RNA CRISPRi screen identifies PRANCR as a novel regulator of epidermal homeostasis.</a> Genome Res. 30 (1), 22-34 (2020).</li>
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<li>Ma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+labeling+of+genomic+loci+with+dCas9+and+engineered+sgRNAs+using+CRISPRainbow%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multiplexed labeling of genomic loci with dCas9 and engineered sgRNAs using CRISPRainbow.</a> Nat Biotechnol. 34 (5), 528-530 (2016).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.45 & ミュー;m 精密ろ過用メンブレン</td><td>Sartoriu</td><td>16533K-1</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL EPチューブ</td><td>LABLEAD</td><td>MCT-150-CLD-1</td><td></td></tr><tr><td>10 cmディッシュ</td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>15 mLチューブ</td><td>LABLEAD</td><td>LXG1500</td><td></td></tr><tr><td>1 mL滅菌シリンジ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2x Accurate Taq Master Mix (dye plus)</td><td></td>コ<td></td><td>ロニーPCR用正確な生物学AG11010</td></tr><tr><td>50 mL チューブ</td><td>LABLEAD</td><td>LXG5000</td><td></td></tr><tr><td>5-フルオロウラシル</td><td>シグマ</td><td>F6627-1</td><td></td></tr><tr><td>6 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;mセルふるい</td><td>Falcon&reg;</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 ウェルプレート</td><td>Corning</td><td>3599</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Leagene</td><td>CS0001</td><td></td></tr><tr><td>寒天</td><td>BIODEE</td><td>DE0010</td><td></td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Solarbio</td><td>A8180</td><td></td></tr><tr><td>Applied Biosystems PCR 用サーマルサイクラー</td> サー<td>モフィッシャー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>セルカウンティングキット-8</td><td>Bimake</td><td>B34304</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>eppendorf</td><td>遠心分離機 5810R</td><td></td></tr><tr><td>CO2 インキュベーター</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>DNA Clean&コンセントレーター-5</td><td>ZYMO</td><td>D4014</td><td></td></tr><tr><td>Dneasy Blood &Tissure キット</td><td>Qiagen</td><td>69504</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmbI)</td><td>NEB</td><td>R0580L</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>ExCell</td><td>FSP500</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad プリズム 9.3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEK-293T</td><td>ATCC;米国</td><td></td><td></td>バージニア</tr>州 <tr><td>HEPEs</td><td>Sigma</td><td>V900477</td><td></td></tr><tr><td>KOD-Plus-Neo</td><td>TOYOBO</td><td>KOD-401</td><td></td></tr><tr><td>lentiGuide-Puro</td><td>Addgene</td><td>52963</td><td>バックボーンベクター</td></tr><tr><td>LSL-Cas9 マウス</td><td>モデル Animal Research Center of NANJING UNIVERSITY&nbsp;</td><td>T002249</td><td></td></tr>マイクロ<tr><td>プレート吸光度分光光度計</td><td>BIO-RAD</td><td>xMark&trade;</td><td></td></tr><tr><td>Nacl</td><td>Rhawn</td><td>R019772</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td>P1003</td><td></td></tr><tr><td>PEI</td><td>Proteintech</td><td>B600070</td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン - ストレプトマイシン溶液、100x</td><td>Solarbio</td><td>P1400</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G プラスミド</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>ポリブレン</td><td>Beyotime</td><td>C0351</td><td></td></tr><tr><td>ポリイノシン-ポリシチジル酸ナトリウム塩</td><td>Sigma</td><td>P1530</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR 精製キット&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-3</td><td>ペプロテック</td><td>213-13-10ug</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスIL-6</td><td>ペプロテック</td><td>216-16-2ug</td><td></td></tr><tr><td>組換えマウスSCF</td><td>ペプロテック</td><td>250-03-10ug</td><td></td></tr><tr><td>レギュラー アガロー</td>ス <td>BIOWEST</td><td>BY-R0100</td><td></td></tr><tr><td>エビ アルカリホスファターゼ (rSAP)</td><td>NEB</td><td>M0371S</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax QuickDrop 超微量分光光度計</td><td>分子 DIVICES</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stbl3 コンピテント セル</td><td>BioMed</td><td>BC108-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>T4 ポリヌクレオチドキナーゼ</td><td>NEB</td><td>M0201L</td><td></td></tr><tr><td>T4-リガーゼ</td><td>Takara</td><td>2011B</td><td></td></tr><tr><td>TIANprep ラピッドミニプラスミドキット</td><td>TIANGEN</td><td>DP105-03</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>LABLEAD</td><td>C0040-100ml</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>トリプトン</td><td>OXOID</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>WEHI-CM</td><td>南京福克サイバイオテクノロジー&nbsp;</td><td>CBP50079</td><td></td></tr>酵母<tr><td>エキス</td>オ<td>キソイ</td>ド<td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Trp53 ノックアウトがマウスHSPCの増殖能に及ぼす影響 ここでは、 Trp53 ノックアウトを例に、このプロトコルを実演しました。 Trp53 ノックアウトがマウスHSPCの増殖能に及ぼす影響を調べるために、レンチウイルストランスフェクションを用いて、5-FU処理後にHSPCに濃縮されたCas9発現骨髄細胞に Trp53 sgRNAを導入しました。同時に、血縁関係のないsgRNAを同腹仔から骨髄細胞にトランスフェクションして、対照群として機能させました。次に、トランスフェクションした細胞を0時間、24時間、48時間、および72時間培養し、CCK-8アッセイを使用して増殖能を評価しました。実験計画を 図 1に示します。CCK-8アッセイの結果は、 Trp53 ノックアウトがコントロールと比較して増殖能を有意に向上させることを示しました(...

CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

evaluation-abnormal-growth-related-genes-hematopoietic-stem

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

CRISPR/Cas9 を使用して、編集対象となる遺伝子は、遺伝子の生物機能の理解を促進しています。ここでは、その発癌性の活動を研究するためにサイトカイン依存性造血細胞のモデル カルレティキュリン変異に CRISPR/Cas9...

CRISPR/Cas9 を使用して遺伝子変異カルレティキュリン サイトカイン依存性造血細胞での発癌性の活動を調査する編集

高速のためのプロトコル マウスに CRISPR/Cas9 を介した遺伝子破壊とひと造血細胞はこの資料に記載されています。Cas9 sgRNA ribonucleoproteins は、sgRNAsの in vitro転写と商業 Cas9...

CRISPR/Cas9 によるマウスおよび人間の造血前駆細胞の高効率遺伝子破壊

本稿では急性骨髄性白血病 (AML) 細胞増殖で複数の候補者の遺伝子の役割を簡単かつ迅速な捜査のためクラスター化定期的に空間短い回文を繰り返す (CRISPR) CRISPR ベース Cas9...

CRISPR ベース Cas9 の競争の試金を使用して遺伝的依存関係の調査

CRISPR/sgRNA ライブラリは、蛋白質コーディングの遺伝子を尋問に適用されています。ただし、CTCF 境界の遺伝子発現制御の機能を明らかにするための sgRNA ライブラリの可能性は未踏のままになります。ここでは、 HOX遺伝子座の CTCF 境界の働きを解明するHOX遺伝子特定 sgRNA...

HOX軌跡 Focused CRISPR/sgRNA ライブラリ スクリーニングを識別する重要な CTCF の境界

CRISPR/Cas9システムによるマウス造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の高効率ゲノム編集のためのプロトコルは、造血系特異的遺伝子改変を用いたマウスモデルシステムを迅速に開発する。...

疾患モデルにおける血化細胞の研究のためのレンチウイルスCRISPR/Cas9媒介ゲノム編集

組み立て済みのCas9/ガイドRNAリボヌクレオタンパク質複合体の直接送達は、血行細胞におけるゲノム編集のための迅速かつ効率的な手段である。ここでは、このアプローチを用いてRUNX1イントロニックサイレンサーを削除し、OCI-AML3白血病細胞における転写応答を調べる。...

急性骨髄性白血病細胞におけるCRISPR/Cas9リボヌクレオタンパク質によるRUNX1イントロニックサイレンサーの転写役割の調査

遺伝子治療アプリケーションのための造血幹細胞および前駆細胞のCRISPR/Cas9遺伝子編集

造血幹細胞生物学および造血悪性腫瘍をよりよく研究するためには、造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の体細胞変異を忠実にモデル化するための新しい戦略が必要です。ここでは、CRISPR/Cas9とデュアルrAAVドナー形質導入の使用を組み合わせることにより、HSPCにおけるヘテロ接合機能獲得変異をモデル化するためのプロトコルについて説明します。...

ヒト造血幹細胞および前駆細胞における発癌性ヘテロ接合性機能獲得変異の改変

提示された方法は、高効率のレンチウイルス媒介遺伝子送達システムを使用して、L2HGDH遺伝子を標的とするsgRNAを安定的に発現するヒト胚性幹細胞(hESC)株H9におけるCRISPR媒介遺伝子ノックアウトの生成を説明するものです。...

フィーダーフリー条件下で培養したヒト多能性幹細胞におけるCRISPR-Cas9媒介遺伝子欠失

CAR T細胞におけるCRISPR-Cas9スクリーニングの改良:ライブラリー調製のための洗練された方法

学ぶ CRISPR/Cas9とCCK-8アッセイを併用した造血幹細胞・前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の同定法。白血病発がん機構の解明と新規治療標的の探索に応用可能です。

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