CRISPR/Cas9技術とセルカウンティングの併用による造血幹細胞および前駆細胞の異常増殖関連遺伝子の評価

研究範囲は白血病の病因です。私たちは、CRISPR/Cas9とCCK-8アッセイを組み合わせることで、異常なHSPC増殖に重要な遺伝子を特定し、腫瘍形成におけるそれらの役割と薬物標的としての可能性を明らかにすることを目指しています。

CRISPR/Cas-9ベースの遺伝子編集は、真核細胞で遺伝子ノックアウトを達成するためのシンプルで効率的なアプローチを提供します。現在の実験課題は、CRISPR/Cas-9 ノックアウト効率をさらに高めることです。

私たちのプロトコルでは、Cas-9マウスを使用して骨髄細胞に相談的Cas-9発現を供給し、それによってSGIを細胞にウイルス送達し、それによって実験効率を大幅に向上させます。

[プレゼンター]まず、安楽死させた実験マウスから大腿骨と脛骨を取得します。無菌性を維持するために、取り外し直後に大腿骨と脛骨を層流フードに移します。1ミリリットルの滅菌注射器を使用して、2%FBSを含むPBSで骨髄腔を洗い流し、骨髄細胞を収集します。骨髄細胞を上下に30〜50回ピペットで移動させ、単一細胞に分散させます。細胞混合物を50ミリリットルのチューブに移し、ボルテックスしてよく混合します。10マイクロリットルの細胞懸濁液を40マイクロリットルの赤血球溶解バッファーに加え、氷上に5分間置いて赤血球を溶解します。次に、50マイクロリットルのトリパンブルー溶液を加えます。よく混合し、生細胞を数えます。次に、細胞を摂氏4度で800Gで15分間遠心分離し、上清を吸引します。次に、10の1〜2倍の濃度で、1ミリリットルあたり6細胞の累乗、プレ刺激培地で細胞を再懸濁します。そして、10ミリリットルの懸濁液を10センチメートルの皿に種をまきます。皿を摂氏37度で24時間インキュベートします。翌日、事前に刺激された細胞を収集するには、2%FBSを含む5〜10ミリリットルのPBSを加え、プレートを激しくすすぎます。細胞を新しいチューブに移し、トリパンブルーを細胞に加えます。混合物中の生細胞を数えます。次に、細胞を室温で800Gで10分間遠心分離します。上清を廃棄した後、1ミリリットルあたり6細胞の累乗約10の濃度で、新たに調製したスポゼンテーション溶液に細胞を再懸濁します。4ミリリットルの懸濁液を6ウェルプレートの各ウェルに播種します。プレートをパラフィルムで密封し、1,500 Gで摂氏32度で90分間遠心分離します。遠心分離後、培地を変更せずにピペットで細胞を静かに再懸濁します。プレートを4〜6時間インキュベートします。最初のトランスフェクションでは、各ウェルから約3ミリリットルの上清培地をチューブに吸引し、同量の骨髄前刺激培地を加えます。細胞が誤って吸引された場合は、前述のように遠心分離と再懸濁のステップを繰り返します。二次トランスフェクションでは、翌日、各ウェルから2〜3ミリリットルの培地を取り出し、同量の解凍したてのレトロウイルス原液を適切な量のヘパスとポリグリーンとともに加えます。プレートを摂氏37度で1,500 Gで90分間遠心分離します。遠心分離後、細胞を穏やかに再懸濁し、4〜6時間インキュベートを続けます。次に、前述のように培地を交換し、24時間インキュベートします。2%FBSを含むPBSでプレートを洗浄し、細胞を回収します。トリパンブルーを使用して生細胞をカウントする前に、70マイクロメートルのふるいで細胞をろ過します。次に、細胞を室温で800Gで10分間遠心分離します。10%FBSとマウスインターロイキン-3、インターロイキン-6、および幹細胞因子を含むDMEMに細胞を再懸濁します。約0.5〜1x10を800 Gで6つの細胞の累乗に5分間遠心分離し、上清を廃棄します。ゲノムDNA抽出のために細胞ペレットを摂氏-80度で保存します。次に、ウェルあたり4細胞の累乗に1x10を96ウェルプレートに追加し、グループごとに6つの複製ウェルを作成します。次に、100マイクロリットルの滅菌PBSを周囲のウェルに加え、0、24、48、および72時間の異なる時点までインキュベートします。各時点で培地を吸引し、1/10 体積の CCK-8 溶液を含む 110 マイクロリットルの培地をウェルに加えます。混合物を1時間インキュベートします。最後に、マイクロプレート分光光度計を使用して450ナノメートルの吸光度を測定します。Trp53ノックアウトは、CCK-8アッセイで測定した24、48、および72時間で、対照と比較してマウス、造血幹細胞、および前駆細胞の増殖能力を有意に増加させました。Trp53の編集効率は、TIDE分析を使用して7.3%と推定されました。 そして、次世代シーケンシングにより、遺伝子のさまざまな位置で変異が発生していることが明らかになりました。