高倍率生細胞共焦点蛍光顕微鏡用等二軸延伸装置

私たちは、生理学的および病理学的文脈で細胞が機械的刺激にどのように反応し、適応するかを研究します。このために、ストレッチ装置を使用して、外力(この場合はひずみ)を細胞に加えます。

私たちは、細胞と細胞組織が特定の機械的刺激にどのように反応するか、そしてそれらが他の生物学的手がかりにどのように機械的に反応するかを発見しました。

当社のストレッチ装置は、異なる剛性のポリアクリルアミドゲル上で培養した細胞をストレッチしたり、圧縮実験を行ったりできるため、他のストレッチ装置と比較して非常に汎用性が高いです。

[ナレーター]まず、PMMA リングを白いベンチ ペーパーの上に置きます。PDMSコーティングされたプレートの端をブレードで慎重に回し、全周に沿ってきれいにカットします。ピンセットを使用して膜の片方の端を持ち上げ、親指でそっと剥がして、膜の半分をプレートから均一に剥がします。指を使って、PMMAリングの上面全体に96%エタノールを均等に広げます。PDMSメンブレンを以前に持ち上げた端から持ち上げて、プレートから慎重に取り外します。次に、エタノールで覆われた PMMA リングに対称的に置き、伸びを防ぎながらしわがないようにします。次に、別の空のPMMAリングを取り、取り付けリングの上に置きます。金属クリップを使用してそれらを密閉し、PDMS メンブレンを 2 つのリングの間に挟み込みます。ストレッチリングの下半分を取り付けサポートに配置します。PDMS リングをストレッチ リングに挟み込み、完全に収まるまでしっかりと押し下げて、ガスケットが正しい位置にあることを確認します。円形の真鍮の重りをサンプルの上に置きます。次に、金属製ストレッチリングの上半分を上に置き、ネジ穴を合わせます。すべてのネジを挿入して締めます。ブレードを使用して、リングの周りのPDMSを優しく切断します。膜をほこりから保護するために、アセンブリをペトリ皿で覆います。連続希釈を使用して、PBS中の0.2マイクロメートル蛍光ビーズの250,000希釈液を1回調製します。そして、PDMSの中心に10〜30マイクロリットルのビーズ溶液を一滴垂らします。硬化後の交絡問題を避けるために、摂氏 40 度以下の温度で乾燥させてください。次に、ストレッチ装置を顕微鏡ステージホルダーに取り付け、ストレッチポストを顕微鏡に固定します。ポストの円形の領域に潤滑剤をたっぷりと塗布します。準備したストレッチリングをストレッチポストに取り付け、トップキャップをねじ込んでアセンブリを密閉します。次に、真空コントロールボックスの背面を真空源に接続し、次にボックスの前面をストレッチポストに接続します。ひずみキャリブレーションを実行するには、ビード密度が高く、ユーザーが認識できるビード塊を含む関心のあるフィールドを選択します。選択した視野の静止した画像を取得し、位置を保存します。負20ミリバールの低真空レベルでストレッチを適用し、全方向に動きます。ここで、Z平面で焦点を合わせ直し、ステージをXY方向に動かして、同じ関心領域を見つけ、引き伸ばされた状態で画像を取得します。次に、ひずみを解放し、より高い真空レベルで手順を繰り返します。取得した画像は、サンプルごとに整理されたフォルダーに保存します。名前、reference_str1としてストレッチなしで取得された参照ビード画像と、stretched_str1、stretched_str2、stretched_str3など、真空レベルを上げてストレッチされた画像。ひずみを定量化するには、MATLAB を開き、ゲルひずみコードを読み込みます。パラメーターを設定したら、親と実験フォルダーのパスを定義し、コードを実行します。次に、コードの要求に従ってstretched_str1を開き、その後にreference_str1を開きます。次に、各真空レベルの中央値ひずみ行列を計算します。少なくとも3つのサンプルに対してこのプロセスを繰り返した後、中央ひずみマトリックスと真空レベルをプロットして、検量線を取得します。PDMSリングをコーティングするには、紫外線で15分間滅菌します。バイオセーフティキャビネットの下で、ボンネットの下のプレートを滅菌PBSですすいでください。プレートをすすぐために使用したすべてのPBSを吸引した後。リングの中央に100〜200マイクロリットルの溶液を滴下します。PDMSメンブレンの底側から油性マーカーで液滴の周囲を描き、インキュベートします。実験当日、接着タンパク質をPBSで洗浄します。細胞をトリプシン処理した後、細胞計数に進みます。適切な数の細胞を約20〜50マイクロリットルの少量に標準的な細胞培地で播種して付着を促進し、湿度制御付きの二酸化炭素インキュベーターでインキュベートします。 20〜30分後、細胞の上に500マイクロリットルの培地をそっと加え、プレートをインキュベーターに戻して、細胞をさらに広げます。単一のストレッチリリースサイクルとイメージングの場合は、前に示したようにストレッチリングを顕微鏡ステージに取り付けます。目的のセルを見つけたら、その位置を記録し、事前に引き伸ばされたセルの画像をキャプチャします。検量線に基づいて、必要な基質ひずみに対応する所望の真空レベルを適用して、セルを伸ばします。ストレッチセルを見つけるには、まずZ平面にフォーカスを再調整します。次に、XY 方向に移動して、セルを視野の中央に配置します。希望の時間で画像を記録します。セルの元の位置に移動し、顕微鏡の取得モードをアクティブにして、焦点を合わせ直すとすぐに画像キャプチャが開始されるようにします。ストレッチを解除し、Z平面で手動ですばやく焦点を合わせ直します。放出された細胞の画像を必要な時間キャプチャし、取得全体を通してフォーカスを手動で調整します。後処理のために、Fijiを開き、静止時およびひずみ中に取得した画像をロードします。Fiji プラグイン テンプレート マッチングを使用して、配置するセルの領域を選択します。校正により、適用されたひずみの再現性と制御が保証され、真空とひずみの間に最大20%のほぼ線形の関係が確認されました。半径方向変位解析により、PDMS膜上のひずみの等方性と均一性が実証されました。生細胞延伸下での線維芽細胞の蛍光イメージングにより、伸張放出時に膜陥入が明らかになり、3〜5分以内に再吸収されました。固定細胞を再伸ばすことで、伸ばされた状態でのイメージングが可能になり、人工的な折り畳みアーティファクトが防止されました。パターン化されたグリッドを備えたPDMSメンブレンは、マルチモーダルイメージングを容易にし、蛍光および走査型電子顕微鏡で同じ細胞の局在化を可能にしました。フィブロネクチンでコーティングされた柔らかいPAAゲル上に座った細胞は、非ストレッチ細胞と比較して、特定の周期的ストレッチサイクルに服従した場合にのみ焦点接着を形成しました。