ネイティブγH2Aによる一般的な脆弱サイトブレークのキャプチャ。X ChIPの

私たちの贅沢は、年代測定を失うこと、腫瘍の再発生におけるジャイブにおける一般的な壊れやすい部位の不安定性の役割に焦点を当てています。治療的に利用できる癌遺伝子ジャイロンがん細胞のウイルス移動性を特定してみてください。それ以外の場合、イメージングおよび単一細胞シンパシーや生細胞イメージングなどのシーケンシング技術により、質量におけるゲノムの不安定性を高解像度でマッピングできます。

ノイズを含む領域のin vivoモデル、遺伝子操作マウスモデル、CRISPR基底システムを利用して、癌遺伝子ゲノム不安定性のメカニズムを詳細に調べます。私たちの研究室の長期的な関心は、正常細胞への害を最小限に抑えることに重点を置いて、感染治療のために戦略的に治療できるがん細胞の特定の弱点を特定することです。これには、通常の治療の機会を明らかにするための遺伝的およびエピジェネティックな脆弱性を調査することが含まれます。

まず、HEK 293 T細胞をDMSOエチルデコリンとヒドロキシ尿素で3つの異なるプレートで24時間処理します。細胞をPBSで2回洗浄した後、摂氏4度で500 Gで4、5分間遠心分離します。ペレットを500マイクロリットルの新しく調製したコールドバッファーAに再懸濁し、氷上で5〜10分間インキュベートします。

溶解の進行を光学顕微鏡で観察し、細胞溶解の完全性を確認します。溶解したら、細胞懸濁液を摂氏4度で5分間500Gで遠心分離し、核ペレットを500マイクロリットルのコールドバッファーAに再懸濁します。再度遠心分離し、5〜10回ピペッティングして、100マイクロリットルのミクロコッカスヌクレアーゼ緩衝液で無傷の核を再懸濁します。所定量のミクロコッカスヌクレアーゼをサンプルに直ちに添加します。

チューブを摂氏37度で5分間回転子に置きます。すぐにチューブを氷に戻し、EDTAを加えて消化を終了します。ボルテックス後、500マイクロリットルのバッファーBを加え、ピペットを上下に調和して混合します。

チューブを氷上で5分間インキュベートして、タンパク質を可溶化します。不溶性物質をペレット化するには、サンプルを摂氏4度で5分間最高速度で遠心分離します。透明な上清を、天然クロマチン画分として標識された新しい1.5ミリリットルのチューブに移します。

クロマチンの断片化を確認するには、10マイクロリットルの上清を新しい1.5ミリリットルのチューブに分注します。上清を20マイクロリットルの蒸留水と30マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールと混合します。激しいボルテックス後、チューブを摂氏4度で10分間20, 000 Gで遠心分離し、透明な最上層、白い中間層、黄色の下層の3つの異なる層を観察します。

DNAを含む20マイクロリットルの上部水相を新しいチューブに慎重に移します。精製したDNAを1.5%アガロースゲル中で100ボルトで30分間分離します。消化パターンを視覚化し、クロマチンフラグメントのサイズが主に200〜1, 000塩基対であることを確認します。

180マイクロリットルの溶出バッファーを含む20マイクロリットルの消化クロマチンを各チューブに移します。チューブに入力サンプルとしてラベルを付け、摂氏マイナス20度で保管します。400マイクロリットルの消化クロマチンを別の1.5ミリリットルのチューブに加え、クロマチン免疫沈降またはチップ化します。

ガンマH2 AX抗体をDMSO処理、エチルデコリン処理、およびヒドロキシ尿素処理サンプルに移します。チューブを摂氏4度の回転器に5時間、またはできれば一晩置きます。一方、幅の広いオリフィスチップを使用して、100マイクロリットルのチップグレードの磁性タンパク質AGビーズを新しい1.5ミリリットルチューブに分注します。

チューブを磁気スタンドに1分間置き、液体を慎重に捨てます。次に、0.5%BSAを含む1ミリリットルのPBSにビーズを再懸濁します。チューブを摂氏4度で4時間回転させます。

チューブを磁気スタンドに1分間戻し、上清を捨てます。2回目の洗浄後、事前にコード化されたビーズを100マイクロリットルのバッファーBに再懸濁します。25マイクロリットルの事前にコード化された磁気ビーズ懸濁液を各チップサンプルチューブに加えます。チューブを摂氏4度で2時間回転させ、チップチューブを磁気スタンドに置き、ビーズがチューブの側面に付着して溶液が透明になるまで待ちます。

磁気ビーズを乱すことなく、透明な上清を廃棄します。ビーズを1ミリリットルの洗浄バッファーに再懸濁し、摂氏4度で10分間回転させます。チューブを磁気スタンドに戻し、溶液が透明になるまで待ってから洗浄バッファーを廃棄します。

最終洗浄後、チューブを摂氏4度で30秒間400Gで短時間遠心分離し、残留液体を除去します。チューブを磁気スタンドに戻し、チューブの底に残っている液体を慎重に取り除きます。チップ抗体のプルダウン効率を確認した後、ウェスタンブロットを使用して、残りのチップサンプルのそれぞれに50マイクロリットルの溶出バッファーを追加します。

チューブをサーマミキサーの上に置き、室温で15分間振とうします。チューブを磁気ホルダーに1分間置き、溶出液を新しいチューブに集めます。各チップ溶出サンプルに100マイクロリットルの溶出バッファーを追加し、各入力サンプルに180マイクロリットルの溶出バッファーを追加します。

次に、200マイクロリットルのフェノールクロロホルムイソアミルアルコールを各サンプルに加え、チューブを激しくボルテックスして混合します。サンプルを遠心分離した後、上部の水層を19マイクロリットルの3モル酢酸ナトリウムと2マイクロリットルのグリコーゲン溶液を含むチューブに慎重に移します。チューブをボルテックスして混合します。

各サンプルに500マイクロリットルの100%エタノールを加え、完全にボルテックスします。チューブを摂氏マイナス20度で2時間、または一晩置いてDNAを沈殿させます。次に、上清を廃棄する前にチューブを遠心分離し、ペレットを1ミリリットルの70%エタノールに再懸濁します。

遠心分離によって残留エタノールが除去されたら、DNAペレットを2〜3分間自然乾燥させてから、400マイクロリットルのTEバッファーに再懸濁します。ミクロコッカスヌクレアーゼの濃度が高いと、クロマチンの消化がより広範囲に行われ、その結果、モノヌクレオソーム断片が優勢になりました。対照的に、ミクロコッカスヌクレアーゼ濃度が低い場合、クロマチンフラグメントの大部分はより大きく、しばしば1キロ塩基を超えました。

ガンマH2 AXレベルは、ネイティブチップと架橋チップの両方の入力サンプルに示されているように、DMSO処理された対照と比較して、エチルデコリンで処理された複製ストレス細胞で有意に上昇しました。