がん遺伝子由来の転写-複製コンフリクトを研究するための近接ライゲーションアッセイ

サマリー

ここでは、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を使用して、がん遺伝子によって誘導される転写複製コンフリクト(TRC)を検出するための高感度で特異的な方法を紹介します。このアプローチでは、PCNAおよびリン酸化CTD RNAPIIを標的とする特異的抗体を活用し、RNAポリメラーゼII転写とDNA複製機構との間のTRCの有病率の評価を可能にします。

要約

DNA複製とRNA転写はどちらもゲノムDNAをテンプレートとして利用するため、これらのプロセスを空間的および時間的に分離する必要があります。複製機構と転写機構との間の対立は、転写-複製競合(TRC)と呼ばれ、がん発生の重要な要素であるゲノムの安定性にかなりのリスクをもたらします。これらの衝突を制御するいくつかの要因が特定されていますが、直接的な視覚化と明確な解釈のためのツールが限られているため、主な原因を特定することは依然として困難です。本研究では、PCNAに特異的な抗体とRNAポリメラーゼIIのリン酸化CTDを活用して、近接ライゲーションアッセイ(PLA)を用いてTRCを直接可視化します。このアプローチにより、RNAポリメラーゼIIによって媒介される複製プロセスと転写プロセスの間のTRCの正確な測定が可能になります。この方法は、これらの抗体に共有結合したDNAプライマーと蛍光プローブを使用したPCR増幅を組み合わせることでさらに強化され、内因性TRCを検出するための高感度で特異的な手段を提供します。この技術は、直接的なTRC可視化のギャップを埋め、細胞内のゲノム不安定性を引き起こす根本的なプロセスのより包括的な分析と理解を可能にします。

概要

ゲノムは、複製や転写などの重要な生物学的プロセスのテンプレートとして機能します。健康な細胞では、RNA転写機構とDNA複製機構は通常協力し、空間的および時間的に分離されています1,2,3,4。しかし、がん遺伝子の過剰発現などの病理学的条件下では、この調和のとれた協力が損なわれる可能性があります。

がん遺伝子はしばしば転写レベルを上昇させ、転写機構と複製機構との間の衝突の可能性を高めます⁵。一部のがん遺伝子はクロマチンの構造を変化させ、転写に利用しやすくしますが、複製フォークの進行を妨げる可能性があります⁵。さらに、がん遺伝子の活性化は、細胞周期を加速することにより複製ストレスを誘発することができます⁶。RNAポリメラーゼII(RNAPII)の活性は、Rbのサイクリン依存性キナーゼ(CDK)リン酸化によりG1/S相移行中に有意に上昇し、サイクリン、CDK、ハウスキーピング遺伝子などの必須タンパク質の転写を促進するE2....

プロトコル

1. レンチウイルスの産生と標的細胞株への形質導入

1. レンチウイルス生産²⁴
   1. 高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(DMEM;完全培地)で、10cmプレートあたり3×10⁶ 細胞で293Tパッケージングセルを播種します。加湿した5% CO₂ インキュベーターで37°Cで細胞をさらに18〜20時間増殖させます。
   2. 2本の1.5 mLチューブに、9.2 μgのpsPAX2、2.8 μgのpMD2.G、および12 μgのpLVX-KRASプラスミドまたは空のベクターを含む500 μLのOpti-MEM(還元血清培地)に合計24 μgのプラスミドDNAのDNA混合物を調製します。
      注:エンドトキシンはトランスフェクション効率を大幅に低下させるため、精製中にプラスミドからエンドトキシンを除去することをお勧めします。
   3. 144 μL のポリエチレンイミン (PEI; 1 mg/mL) を還元血清培地 1 mL に希釈し、混合し、室温 (RT) で 5 分間インキュベートします。
   4. 希釈したDNA混合物に希釈したPEI500 μLを滴下し、チューブを静かにフリックします。PEI/DNA混合物を室温で15分間インキュベートします。
   <....

結果

γH2AXは、DNA損傷のバイオマーカーとして機能します。KRAS(G12D)の過剰発現は、ウェスタンブロット解析におけるγH2AXシグナルの増加によって証明されるように、これらの細胞のゲノム安定性を損ないます(図2A)。さらに、ベクターコントロールと比較してKRAS(G12D)発現細胞におけるS9.6ドットブロットシグナルの強化(図2B)は、発がん性KRAS発現が異常なRループの蓄積につながり、DNA切断形成に寄与する可能性があることを示しています。

図3は、近接ライゲーションアッセイ(PLA)の代表的な画像を示しています。これらの画像では、核内の明るい緑色の点は、PCNA関連複製複合体とRNAPII転写複合体の間の距離が40 nm未満であることを示しています。ベクターコントロール細胞では、緑色の点はほとんど検出されませんが、KRAS(G12D)を発現する細胞では、核ごとに複数の緑色の点が観察されます。.......

ディスカッション

RNAPII転写機構は、DNA複製フォークの進行^26,27に障害を作り出す可能性があり、特に癌細胞^28,29においてTRCとDNA損傷を促進する。TRCを制御するタンパク質を解読し、その詳細なメカニズムを理解することで、これらの有害な事象がどのように発生するのかを理解し、将来の新しい治療アプローチの開発を導くことができます。したがって、TRCを完全に理解するためには、TRC検出のための迅速で信頼性の高い方法が不可欠です。

ここでは、 in situ PLAアッセイを使用して転写複製コンフリクト(TRC)の発生率を調べる手順について説明します。このアプローチにより、細胞内の発がん性シグナル伝達の存在下でのTRC頻度の推定が容易になります。高価な機器や大量の出発材料は必.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
クラリティ ウェスタン ECL 基質	バイオ・ラッド	1705061
Duolink In Situ 検出試薬 グリーン	シグマ	DUO92014
FLAG 抗体	ミリポア	F7425
γ H2AX 抗体	細胞シグナル伝達	25955
グリコーゲン、分子生物学グレード	サーモフィッシャー	R0561
画像 J	NIH	の https://imagej.net/ij/
ニトロセルロースメンブレン	アマシャム	10600004
PCNA 抗体	細胞シグナル伝達	13110
pLVX-Kras G12D	N/A	N/A
pMD2.G	addgene	12259
プロテイナーゼK、組換え、PCRグレード	ThermoFisher	EO0491
psPAX2	Addgene	12260
RNAPII抗体	SCBT	sc-56767
S9.6抗体	活性モチーフ	65683
UV架橋剤	フィッシャーサイエンティフィック	FB-UVXL-1000