ブリルアン分光法を用いた球体の機械的マッピング

私たちはブリルアン分光法を用いて非侵襲的に細胞力学を評価し、メカノバイオロジーが疾患進行に果たす役割を理解しています。ブリルアン分光法のような非侵襲的技術により、試料を乱すことなく三次元で力学を特徴付けることができます。まず、マイクロウェルプレートのウェルに500マイクロリットルの接着防止洗浄液を前処理します。

皿を1,300gで室温で5分間遠心分離します。気泡を除去した後、ウェルから接着防止洗浄液を取り除きます。次に、各ウェルにPBSを1ミリリットル加え、完全に吸引します。

PBS洗浄を繰り返した後、実験デザインに従って球状体あたりの細胞数およびゲルあたりの球状体数を決定します。細胞をペレット状にし、補充されたDMEMを1ミリリットルに再懸浮させます。次に、この細胞懸濁液を1ミリリットルのマイクロウェルプレートの1ウェルに加え、よく混ざります。

プレートを室温で100gで3分間遠心分離します。顕微鏡でマイクロウェルプレートを観察し、細胞の均等分布とウェルの底に沈降しているかを確認しましょう。細胞を37度の温度で5%二酸化炭素とともに24時間培養し、球状体形成を促します。

球体を収穫するには、球体を乱さずに培養培地をゆっくりと慎重に除去します。PBS/FBSコーティングされたピペットの先端を切り開き、各ウェルに500マイクロリットルのPBSを加えて球体を外します。球状体を含むPBSをチューブに集めてください。

次に、96ウェル板の1つのウェルに50マイクロリットルの球状懸濁液を移します。数えるために、油井の底に永久マーカーで十字を描き、顕微鏡でこの体積内の球体数を数えます。この方程式を使って球体の総数を計算します。

SpectraLokソフトウェアを開き、接続されたすべてのデバイスが検出されるまで待ちます。次に分光計カメラを選択します。アクリルキューブを顕微鏡サンプルホルダーに取り付け、透明面が対物レンズの方を向くようにします。

対物レンズをできるだけ下げて、その下のキューブを中央に合わせます。顕微鏡の光学経路を分光器カメラが露出するように設定し、回転ポートセレクターをSpectraLokカメラのウィンドウに回 L.In、センサー露出時間を500ミリ秒、ソフトウェアゲインを100に設定します。キャプチャを押し、対物レンズをゆっくり上に動かします。

レンズを持ち上げ続け、ブリルアンピークが見えてその強度が安定するまで進みます。これは焦点スポットがアクリルキューブ内に位置していることを示します。さて、ポンプキラー、つまりPKコントロールのウィンドウを開けてください。最も明るいブリルアンオーダーの一つにズームインし、圧力アクチュエータの位置を100マイクロメートル単位で調整することで、レイリーピーク強度を最小化します。

レイリー信号が強まった場合は、リバースをクリックして調整方向を変更してください。レイリーピーク強度が低下したら、エタロン圧力を10マイクロメートル単位で微調整します。カメラウィンドウでブリルアンの命令の一つをズームインしてください。

Sボタンを押すと、LUTがカメラ画像に適用されるストライプを視覚化できます。設定ウィンドウを開き、「クイックキャリブレート」を押すと、ストライプの最適な水平オフセットを自動的に再計算します。ストライプのアライメントを確認した後、コリメータレンズ軸を調整し、ポンプキラーから分光計への光の結合効率を最大化します。

次にSpectrumウィンドウを開き、「アンラップ」をクリックしてスペクトラムを取得します。均質アクリルキューブでは、レイリー信号を完全に抑制し、ブリルアン信号がはっきり見えるまで調整します。最適化されたパラメータを保存するには、PKコントロールウィンドウで「すべて更新」をクリックし、その後「すべて保存」を選びます。

最後に、メインウィンドウで「ファイルI/O」セクションの「保存」をクリックして設定を保存します。スキャンソフトを開いた後、アクリルキューブの代わりにヒドロゲル球体サンプルを入れたガラス底のペトリ皿を設置します。ペトリ皿の蓋を外し、ジェルを浸すのに十分な培地を加え、ゲルの動きを防ぐためにカバースリップをその上に置きます。

まずレーザービームを遮って球体の位置を特定してください。顕微鏡の光学経路を接眼レンズに切り替え、白色光の照明をオンにします。ジョイスティックを使ってサンプルステージを手動で操作し、球体を位置づけて焦点を合わせます。

球体の明界画像を取得し、制御ホイールを回転させて照明明るさを調整します。光学経路をRに切り替えて顕微鏡カメラを露光し、必要に応じて露光時間を設定します。次に顕微鏡ポートをLに設定し、レーザーが遮られたまま背景をキャプチャします。

レーザーのブロックを外し、望ましい信号対雑音比に応じて200ミリ秒から500ミリ秒の露光時間を選択します。アンラップされたスペクトラムの中から、ブリルアンピークフィッティングレンジを選びましょう。閾値をブリルアンピーク強度の約半分に調整し、閾値以下の振幅を持つブリルアンピークは除外します。

すべての識別されたブリルアンピークペアに応じてレーザーに波長補正を適用します。最後に、スキャン幅とステップサイズを調整してラスタスキャンのジオメトリを選択し、スキャンを開始して測定を記録します。ハイドロゲル中に埋め込まれた間葉質幹細胞球体の代表画像では、ブリルアンシフトとブリルアン線幅マップ、対応するブライトフィールド、核、アクチンフィラメントの蛍光画像が明確に示されました。

低解像度のブリルアン周波数シフトマップは、明視野画像から手動でトレースされた輪郭に基づき、ゲル領域と球状領域に分割されました。ダウンサンプリングによる曖昧なピクセルは解析から除外され、ゲルおよび球状領域のクリアな二値マスクを作成しBFS値を抽出しました。高分解能と低分解能BFSマップの比較により、コアサンプリングは高分解能スキャンと同等の平均BFS値を提供し、球体体力学の一貫した測定を示しました。

私たちのプロトコルは、研究者が機械生物学に関連する多くの疾患を研究できるプラットフォームを提供します。細胞力学的特性と相関するブリルアンシフトの変化が、病気の進行段階を示す有効なマーカーになるかどうかは興味深いところです。私たちは、疾患の進行を模倣する時間スケールで、薬物治療が球状体力学にどのように影響を与えるかを評価します。