Paired Cisterna Magna Nanoinjection and Laser Speckle Contrast Imaging Assay to Study Cerebral Blood Flow Regulation <em>In Vivo</em>

Zhongxiao Fu; Chia-Yi Kuan

doi:10.3791/67544

In vivoでの脳血流調節を研究するためのCisterna Magnaナノインジェクションとレーザースペッ...

JoVE Journal
Neuroscience

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JoVE Journal Neuroscience

Paired Cisterna Magna Nanoinjection and Laser Speckle Contrast Imaging Assay to Study Cerebral Blood Flow Regulation In Vivo

In vivoでの脳血流調節を研究するためのCisterna Magnaナノインジェクションとレーザースペックルコントラストイメージングアッセイの組み合わせ

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06:24 min

July 8, 2025

DOI: 10.3791/67544-v

Zhongxiao Fu¹, Chia-Yi Kuan¹

¹Department of Neuroscience, Center for Brain Immunology and Glia (BIG),University of Virginia School of Medicine

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study investigates cerebral blood flow regulation in the brain by developing a minimally invasive approach utilizing nanoinjector-guided injections and laser speckle imaging. The research focuses on understanding how microglia and exercise collaborate to maintain vascular functions, particularly in the context of neurodegenerative diseases like Alzheimer's.

Key Study Components

Area of Science

Neuroscience
Cerebral Blood Flow Regulation
Neurodegenerative Diseases

Background

Understanding brain vascular reactivity is crucial for insights into health and disease.
Microglia play a key role in regulating vascular function.
The effects of neurodegenerative conditions on cerebral blood flow are important for developing treatment strategies.
Traditional methods for studying blood flow are often invasive and damaging.

Purpose of Study

To investigate how microglial cells modulate cerebral blood flow and neurovascular coupling.
To develop a technique that allows for the preservation of brain structures during experimentation.
To understand the interplay between vascular reactivity and neurodegenerative disease mechanisms.

Methods Used

Minimally invasive technique combining nanoinjector-guided ICM injections and laser speckle contrast imaging.
Utilization of C57BL/6 male mice as the biological model for testing.
Steps included anesthetizing mice, hair removal, and sterile surgical procedures for accessing the brain.
Critical timing for recording baseline cerebral blood flow before and after infusion of vasodilators.

Main Results

Injection of vasodilators such as DHPG and acetylcholine induced significant increases in cerebral blood flow.
The response of cerebral blood flow to injections displayed both transient and sustained characteristics depending on the agent used.
Recording revealed valuable data about the dynamics of cerebral blood flow regulation during the study.

Conclusions

This study demonstrates a new method for examining cerebral blood flow while maintaining the integrity of brain tissues.
The work enhances understanding of microglial involvement in vascular function in health and disease contexts.
These insights may inform future research efforts and therapeutic strategies for neurodegenerative conditions.

Frequently Asked Questions

What are the advantages of using a minimally invasive approach?

The minimally invasive approach preserves the integrity of critical brain structures, reducing the risk of damage and allowing for more accurate measurements of cerebral blood flow.

How do you prepare the mice for the procedure?

Mice are anesthetized, and hair is removed from the surgical area to ensure a sterile environment for the procedure. The toe pinch reflex is performed to confirm adequate anesthesia.

What types of measurements are obtained during the study?

The study measures cerebral blood flow changes in response to vasodilator injections using laser speckle contrast imaging.

How does microglial function relate to vascular regulation?

Microglial cells are implicated in maintaining vascular homeostasis. This study explores their role in regulating blood flow during various conditions.

What are potential applications of this method?

This method can be adapted for investigations into various neurovascular disorders and can contribute to understanding the dynamics of cerebral circulation.

Are there any limitations to this study?

While the technique is promising, the study is primarily in animal models, and further research is needed to validate findings in human applications.

in vivoで脳血流調節を研究するために、従来の薬理学的方法は侵襲的であり、しばしば頭蓋骨、硬膜、および軟髄膜を損傷します。本研究では、ナノインジェクターガイド下大脳内(ICM)注入とレーザースペックルコントラストイメージングを組み合わせた低侵襲技術を開発し、頭蓋骨と軟髄膜の完全性を維持しました。

私たちの研究は、健康と病気における脳血管反応性を調節するメカニズムを理解することを目的としています。私たちは、ミクログリアのような宿主細胞の種類と運動が連携して血管機能を維持し、神経変性疾患、特にアルツハイマー病においてこのプロセスがどのように破壊されるかを研究しています。現在のプロトコルを使用して、脳ミクログリア細胞が基礎脳血流と神経血管結合の両方をどのように調節するかを理解することを目指しています。今後は、ミクログリア細胞が止血状態と神経変性状態の両方で脳血管機能をどのように調節するかを調査することに焦点を当てます。

[ナレーター]まず、生後10〜14週の6匹のC57BL / 6雄マウスの体重を量ります。マウスを麻酔した後、つま先ピンチ反射を行い、マウスが完全に麻酔されているかどうかを調べます。綿棒を使って、頭蓋骨の上部と首の後ろに脱毛クリームを塗り、毛を取り除きます。乾燥を防ぐために眼科用軟膏を目に塗布し、処置中は必要に応じて塗り直します。次に、マウスを定位固定フレーム内の腹臥位に置き、医療用空気で換気します。適切に固定し、頭を少し下に傾けて体と120度の角度を形成し、シスターナマグナを露出させます。手術を進める前に、手術部位を70%エタノールで滅菌してください。手術用顕微鏡下で、後頭稜を見つけます。ピンセットを使用して、上にある皮膚を持ち上げ、1センチメートルの正中線切開を行います。処置中の出血を抑えるには綿棒を使用してください。次に、鉗子を使用して首の筋肉を露出させ、両手に1つずつ、2つの湾曲した鉗子を使用して正中線に沿ってそっと分離し、筋肉を慎重に脇に引っ張って大槽を露出させます。次に、頭を下に傾けて体と150度の角度を形成し、シスターナマグナを最適に露出させます。矢状縫合糸に沿って5ミリメートルの切開を行い、ラムダ点とブレグマ点の両方を覆います。2つの湾曲した鉗子を使用して、皮膚をそっと脇に引っ張り、頭蓋骨の表面を生理食塩水できれいにします。レーザースペックルコントラストイメージングシステムのレンズの下にマウスを置きます。次に、露出した頭蓋骨の上に厚さ1ミリメートルの超音波ジェルの層を塗布して、その領域を湿らせます。システムの電源を入れると、付属のソフトウェアが表示されます。自動機能を使用して、イメージングに適したフォーカスを見つけます。次に、ポンプを定位固定マニピュレーターアームに固定し、ケーブルをコントローラーに接続します。コントローラーの電源を入れ、ターゲットポンプを選択します。コントロールパネルで、注入する方向を設定します。速度を毎分 2 マイクロリットルに、容量を 4.5 マイクロリットルに調整します。注入が完了したら、容器からガラスピペットを取り出します。34ゲージのMicroFilフレキシブルニードルまたは同様のタイプのニードルを使用して、ピペットに無色無臭の鉱物油を満たします。次に、ポンプのコレットを緩めます。ガラスピペットを挿入し、コレットをしっかりと締めます。ピペット内に気泡がないことを確認してください。次に、コントロールパネルの方向設定を変更して撤退します。速度を毎分 2 マイクロリットルに、容量を 4.5 マイクロリットルに調整します。定位固定アームを動かして、調製した溶液にピペットをそっと導入します。引き出し機能を使用して、目的のボリュームを抽出します。血管拡張薬を注射する前に、定位固定装置マニピュレーターアームの角度を前後面で45度に調整してください。解剖顕微鏡下で、湾曲したピンセットを使用してシスターナマグナを露出させます。定位マイクロマニピュレーターを使用して、ガラスピペットを大槽硬膜の近くに移動します。ガラスピペットが硬膜に触れたら、静かに動かしてシスターナマグナの中心に通します。次に、コントロールパネルで方向を変えて注入します。注入速度を毎分300ナノリットル、容量を1.5マイクロリットルに設定します。レーザースペックルコントラストイメージングソフトウェアを起動し、焦点を調整して血管の最も鮮明な画像を実現します。コントロールパネルで、フレームレート間隔を5秒に設定します。ベースラインの脳血流を約 10 分間記録し、ベースラインが安定した状態に保たれていることを確認します。10分間の安定したベースライン記録の後、ナノ注入を開始し、記録システムでの注入開始時間を記録します。注入が完了したら、終了時刻をマークし、さらに20分以上記録を続けます。DHPGの注射により脳血流が急激に増加し、注射後に徐々に減少しました。アセチルコリン注射により、20 分間の記録期間を通じて脳血流が徐々に持続的に増加しました。アデノシン注射は脳血流の一時的な増加を誘発し、注射後15〜20分以内にベースラインレベルに戻りました。