Name: 気道内の真菌胞子の空間動態を保存するマウス肺の効率的なイメージング法 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-13T14:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: 学ぶマウス肺の気道内容物を保存する効率的なイメージング法。真菌胞子の自然な位置を維持し、蛍光顕微鏡で詳細な空間分析を可能にする。Coccidioides posadasiiを用いた肺感染モデルで免疫応答を研究する。

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

このプロトコルに記載されているすべての方法は、ラトガース大学生物医学健康科学の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されています。
1. 細胞内蛍光による胞子の標識
<ol>
	<li>カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(CFSE)、Cell Tracker Orange、またはCell Tracker Red(または任意の細胞内色素)で1 x 106 個の胞子を5 μMで30分間、30°Cで染色し、PBSで洗浄し、胞子を12,000 x gで回転させます 。 この洗浄を一度繰り返します。</li>
	<li>25 μLが1匹のマウスに適切な胞子用量を含むように、適切な濃度で胞子接種物を調製します。</li>
</ol>
2. イソフルラン麻酔を用いた吸引吸入によるマウス胞子の接種
注意:イソフルランは揮発性麻酔薬であり、ダクト付きバイオセーフティキャビネットまたはヒュームフード内で使用する必要があります。
<ol>
	<li>イソフルラン曝露ジャーを調製するには、折りたたんだナプキンを 1 L のスクリュートップ Nalgene ジャーに入れ、マウスのプラットフォームとしてナプキンの上にプラスチックメッシュの円を置きます。ナプキンに2mLのイソフルランを加え、瓶を閉じ、ガスが容器内で平衡化するのを1〜2分待ちます。</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig01.jpg"> 
図1:イソフルランオープンドロップ法による胞子接種の装置。 折りたたまれたナプキンを1Lスクリュートップジャーの底に置き、次に円形のプラスチックメッシュを挿入してマウスのプラットフォームとして機能します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol start="2">
	<li>マウスを麻酔にさらす前に、25 μLの接種物を含むピペットを準備します。マウスをイソフルラン容器に入れ、容器を傾けて、マウスが意識を失い、逆さまになっている立ち上がり反射の喪失を監視します。これには通常約 10 秒かかります。</li>
	<li>呼吸数 (RR) が安定して 50-80 呼吸/分 (bpm) に減速するまで、安静時 RR の約 50% まで監視します。通常、これにはさらに 10 秒かかります。このとき、マウスをイソフルランジャーから取り出します。 注:これは高濃度のイソフルランであり、麻酔の迅速な導入を引き起こし、マウスは非常に注意深く監視する必要があります。イソフルランの濃度は変動する可能性があり、イソフルランに対する用量反応曲線は非常に急であるため、致命的なイソフルランの過剰摂取はリスクです。.呼吸数が50 bpmを下回ったり、不規則な場合は、マウスをイソフルランから取り出し、3〜5分間回復させてから、再試行してください(最大2回の繰り返し試行)。</li>
	<li>つま先の挟み込みに対する反応の欠如により、麻酔の深さを確認します。次に、マウスを片手で仰臥位に置き、マウスが3〜5回定期的に息を吐き、速度(50〜60 bpmから開始)と活力を増加させます。これが始まると、ピペットの先端をマウスの中咽頭の後部に配置し、吸入中に接種物を放出します。 注:口からのこれらのあえぎは、呼吸のための付属筋肉の動員により、頭を劣って揺さぶります。これらのあえぎの間にピペットを挿入すると、あえぎごとに口が開くはずです。口が開かない場合、マウスの麻酔が不十分であり、中咽頭から内容物を吸い込まない可能性があります。ピペットは舌を押し下げ、接種物の嚥下を防ぐために口の底と前に向かって押します。ピペットが口の中にあり、マウスが適切に麻酔されているとき、マウスはあえぎごとに口を開けます。</li>
	<li>マウスを握った手と親指で、マウスの胸部の後面と前面にパチパチという音を感じて、接種物の吸入を確認します。</li>
</ol>
3. マウスの安楽死
<ol>
	<li>犠牲時点の10分前に、200 mg / kgケタミンと24 mg / kgキシラジンのカクテルをマウス腹腔内に注射します。.</li>
	<li>マウスが麻酔の手術面に入るまで、注射後10分待ちます。これは、つま先のつま先つまみに対する反応の欠如によって確認されます。</li>
</ol>
4. PBSとホルマリンによる肺の灌流
<ol>
	<li>麻酔をかけたマウスに70%エタノールを噴霧します。はさみを使用してマウスの皮膚を切り取り、皮膚を引き離して腹膜を四方に露出させます。マウスの上半分から皮膚を頭の上に引っ張り、皮膚から腕を引き抜きます。</li>
	<li>胸骨と胸郭の下面に沿って腹膜を切断し、腹膜を露出させます。肝臓を下に変位させ、横隔膜を明らかにします。はさみを使用して、肺の実質から離れて横隔膜を慎重に穿刺し、肺自体に穴を開けないようにします。 注:誤って肺に穴を開けると、その後の空気の膨張が不可能になります。</li>
	<li>横隔膜に穴を開けると、空気が胸部に入り、肺が崩壊します。左側の胸郭を切って心臓を露出させます。50Gの針で5〜10mLのPBSを5秒あたり1mLの割合で右心室に注入し(血管の損傷を防ぐため)、肺を急速に白くします。 注意: ホルマリンは危険な揮発性物質であり、ダクト付きのバイオセーフティキャビネットまたはヒュームフード内で取り扱う必要があります。</li>
	<li>終了したら、針を取り外し、新しい針を使用して、5 mLの10%中性緩衝ホルマリン(NBF)を同じ速度で右心室に注入します。</li>
</ol>
5.灌流された肺を空気で膨らませる
<ol>
	<li>胸郭の前半分を取り外します。気管を露出させるには、首の左右にある上肋骨と鎖骨をカットします。気管が横たわる正中線付近で切断しないように注意してください。鉗子で、首の正中線に残っている上部の肋骨と鎖骨をつかみ、気管が露出するまで上方向に引っ張ります。</li>
	<li>長さ10cmの縫合糸を用意し、気管の下に引っ張り、露出した気管の下端で緩い結び目をあらかじめ結びます。18Gのカテーテルで1mLの空気のシリンジを準備します。18Gの針を使用して、露出領域の上端にある気管に穴を開けます。</li>
	<li>カテーテルをその穴に挿入し、空気が逃げるのを防ぐために比較的しっかりとフィットするようにします。1 mLの空気を10秒間ゆっくりと肺に注入し、すべての葉の肺の膨張を監視します。.完全に膨張すると、肺が心臓をわずかに包み込み、穿刺されていない横隔膜で肺が占める体積が満たされます。</li>
	<li>気管の周りの結び目をしっかりと引っ張り、カテーテルを取り外します。気管を保持し、鈍いハサミを使用してマウスから肺を取り出し、肺に穴を開けないように注意してください。</li>
</ol>
6.浸漬固定と脱水
<ol>
	<li>20 mLの10%NBFで満たされた50 mLの円錐形チューブの上端に肺を置きます。.縫合糸を円錐の外側に保ち、キャップをねじ込み、円錐を反転させて、肺が20mLのNBFで逆さまに吊り下げられるようにします。4°Cで24〜48時間置きます。</li>
	<li>PBSで肺をすすぎ、次に30%ショ糖PBS(w / v)溶液に4°Cで72〜96時間入れて、凍結保存の準備として肺を脱水します。ショ糖から肺を取り出し、肺を最適な切断温度(OCT)培地のクライオモールドに入れ、試料を-80°Cで凍結します。</li>
</ol>
7.クライオセクショニング
<ol>
	<li>OCTクライオブロック内の試料をクライオスタットの-20°C温度まで平衡化してから、切片化に1時間かかります。20-100 μmの厚さでブロックを切片にします。 注:空気の膨張は試料の脆弱性を増大させる可能性があり、厚さを増して切断すると、切片作成中の組織の破損を防ぐことができます。</li>
	<li>切片をスライドガラスに集め、30分から1時間乾燥させて、スライドへの組織の付着を確認します。 注:この段階では、スライドを-80°Cで保持できます。</li>
</ol>
8. スライドの準備とブロッキング
<ol>
	<li>スライドをPBSバス(皿またはCoplinジャー)に室温(RT)で30分間入れて、スライドからOCTを取り除きます。 注:厚いセクション(40〜100μm)は、薄いセクションと同様にスライドガラスに付着しない可能性があるため、Coplinジャーに横に置くのではなく、皿の中で平らで直立させておくのが最善です。</li>
	<li>OCTが組織から溶解した後、スライドを乾燥させます。ワイプを使用して、組織標本の周りのスライドの周囲から余分な液滴を乾かします。 </li>
	<li>疎水性のパップペンを使用して標本の周囲に周囲を描き、5分間乾燥させます。</li>
	<li>0.3% Tween-20および1:100 Fc Blockを含むアニマルフリーブロッキング溶液のブロッキングバッファーを調製します。これは、スライドあたり300 mLです。 注:細胞内標的には、1%Tween-20を使用できます。通常、300 μLの容量で十分ですが、組織を完全に覆うために必要な容量は、疎水性マーカーの周囲サイズによって異なります。この時点から組織は乾燥してはいけません。</li>
	<li>ブロッキング溶液をスライド上にRTで1時間放置します。</li>
</ol>
9. 免疫染色
<ol>
	<li>液体をピペッティングで取り除き、300〜500μLのPBSを加えてスライドを洗浄します。一度洗濯を繰り返します。</li>
	<li>0.33% Tween-20 (または細胞内標的の場合は 1%) のアニマルフリーブロッカー溶液で、一次 AlexaFluor-647 標識ラット抗マウス EpCAM (クローン G8.8) 抗体 (気道上皮マーカー) を調製します。この溶液のスライドあたり300μLを加え、4°Cで一晩染色します。 注:抗体は、染色濃度、時間、および温度について経験的に試験する必要があります。ほとんどの抗体について、薄い切片(8-20 μm)を37 °Cで30分間染色し、厚い切片(20-100 μm)を4 °Cで一晩染色します。非標識抗体を使用する場合は、2回洗浄し(上記の通り)、二次蛍光抗体を経験的に決定した時間と温度で塗布します。一般に、二次抗体の染色は、室温で1時間、希釈倍率1:1000で行います。</li>
	<li>抗体溶液を検体から取り出し、スライドをPBS300 mLで5分間洗浄します。この洗浄を一度繰り返します。スライドを乾燥させ、試験片と周囲のガラスから余分な液体をすべて取り除きます。</li>
	<li>各ティッシュペーパーにRTソフトセット封入剤(SlowFade Glassなど)を1滴加えます。泡が入らないように注意して、ボトルを逆さまにして落ち着かせ、一滴一滴をゆっくりとティッシュに落とします。適切なサイズのカバースリップを、サンプルと疎水性マーカーの周囲を超えて伸びるように配置します。</li>
</ol>
10. 蛍光顕微鏡によるイメージング
<ol>
	<li>マルチチャンネル蛍光顕微鏡を使用して、個々の胞子と宿主細胞を分離するのに十分な解像度の対物レンズを使用して、肺切片全体を偏りなくスキャンします(例:NA = 0.8の20倍油対物レンズを使用したZeiss Axioscan 7など)。 注意: レーザー出力とPMT電圧ゲインが、蛍光マイナス1(FMO)コントロールで決定されたバックグラウンドに対するターゲットの信号対雑音比を最大化するように設定されていることを確認してください。</li>
	<li>肺葉全体をキャプチャするのに十分な画像タイルを収集します(例:サイズ400 μm x 400 μmのタイルを~200枚)。顕微鏡ソフトウェアプログラム(Zeiss ZEN 3.7など)を使用して、マージされたタイル画像をダウンストリーム処理用にエクスポートします。</li>
</ol>
11. QuPathによる空間解析
<ol>
	<li>無料のオープンソースソフトウェアであるQuPath14で、プロジェクトファイルを作成し、蛍光画像をファイルに追加します。</li>
	<li>トップメニューオプションの [分類]をクリックし、[ ピクセル分類]&gt;[しきい値の作成]をクリックして、EpCAM+ピクセルを上皮として分類します。ターゲット領域を最適に識別する解像度、チャネル、スムージング シグマ、およびしきい値を選択します。分類子を一意の名前で保存し、[ オブジェクトの作成] を選択します。</li>
	<li>新しい [オブジェクトの作成 ] ウィンドウで、[ 新しいオブジェクト タイプ ] として [注釈] を選択します。肺上皮の場合、最小オブジェクトサイズと最小穴サイズを100 mm2に設定します。ここで [Split Objects ] を選択する必要はありません。 [OK]を選択すると、注釈が作成され、左上の領域にある ブラシ ツールを使用して目視で変更できます。</li>
	<li>胞子を分類するには、胞子が捕捉されたチャネルを使用して 11.3 から 11.4 の手順を繰り返し、新しいオブジェクト タイプを [アノテーション] ではなく [検出] にします。最小オブジェクト サイズと最小穴サイズを 0 mm2 に設定し、[オブジェクトの分割]を選択します。</li>
	<li>胞子の空間分析を行うには、トップ メニュー オプションの [分析] &gt; [空間分析] &gt; [注釈 2D までの符号付き距離を計算] を選択します。EpCAM+ 上皮までの距離は、検出された胞子ごとに計算されます。これらをトップメニューオプションの 「測定」&gt;「測定値のエクスポート」からエクスポートします。</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>蛍光顕微鏡分析のための肺における真菌胞子局在の保存(英語)

<ol><li>American Society for Microbiology. One Health: Fungal Pathogens of Humans, Animals, and Plants. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Report+on+an+American+Academy+of+Microbiology+Colloquium%22">Report on an American Academy of Microbiology Colloquium</a>. , Washington, DC. (2019).</li>
<li>Crossen, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+airway+epithelium+responses+to+invasive+fungal+infections%3A+A+critical+partner+in+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Fungi+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Human airway epithelium responses to invasive fungal infections: A critical partner in innate immunity.</a> J Fungi (Basel). 9 (1), 40(2022).</li>
<li>Yamamoto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle-size+distributions+and+seasonal+diversity+of+allergenic+and+pathogenic+fungi+in+outdoor+air%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+J%22%5BJournal%5D)">Particle-size distributions and seasonal diversity of allergenic and pathogenic fungi in outdoor air.</a> ISME J. 6 (10), 1801-1811 (2012).</li>
<li>Thakur, A. K., Kaundle, B., Singh, I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aThakur%2C+AK+%22Mucoadhesive+Drug+Delivery+Systems+in+Respiratory+Diseases.Targeting+Chronic+Inflammatory+Lung+Diseases+Using+Advanced+Drug+Delivery+Systems%22">Mucoadhesive Drug Delivery Systems in Respiratory Diseases.Targeting Chronic Inflammatory Lung Diseases Using Advanced Drug Delivery Systems</a>. , Elsevier, Academic Press. (2020).</li>
<li>Darquenne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aerosol+deposition+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Med+Pulm+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">Aerosol deposition in health and disease.</a> J Aerosol Med Pulm Drug Deliv. 25 (3), 140-147 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., Mark, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pathology+of+pulmonary+disorders+due+to+Aspergillus+spp%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Pathol+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">The pathology of pulmonary disorders due to Aspergillus spp.</a> Arch Pathol Lab Med. 132 (4), 606-614 (2008).</li>
<li>Karnak, D., Avery, R. K., Gildea, T. R., Sahoo, D., Mehta, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endobronchial+fungal+disease%3A+An+under-recognized+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Respiration%22%5BJournal%5D)">Endobronchial fungal disease: An under-recognized entity.</a> Respiration. 74 (1), 88-104 (2006).</li>
<li>Amich, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+light+sheet+fluorescence+microscopy+of+lungs+to+dissect+local+host+immune-Aspergillus+fumigatus+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional light sheet fluorescence microscopy of lungs to dissect local host immune-Aspergillus fumigatus interactions.</a> mBio. 11 (1), e02752-e02819 (2020).</li>
<li>Wiesner, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Club+cell+TRPV4+serves+as+a+damage+sensor+driving+lung+allergic+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Club cell TRPV4 serves as a damage sensor driving lung allergic inflammation.</a> Cell Host Microbe. 27 (4), 614-628.e6 (2020).</li>
<li>Evans, S. E., Hahn, P. Y., McCann, F., Kottom, T. J., Pavlovic', Z. V., Limper, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumocystis+cell+wall+%CE%B2-glucans+stimulate+alveolar+epithelial+cell+chemokine+generation+through+nuclear+factor-%CE%BAB-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Pneumocystis cell wall β-glucans stimulate alveolar epithelial cell chemokine generation through nuclear factor-κB-dependent mechanisms.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 32 (6), 490-497 (2005).</li>
<li>Bauer, C., Krueger, M., Lamm, W. J. E., Glenny, R. W., Beichel, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lapdMouse%3A+associating+lung+anatomy+with+local+particle+deposition+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol%22%5BJournal%5D)">lapdMouse: associating lung anatomy with local particle deposition in mice.</a> J Appl Physiol. 128 (2), 309-323 (2020).</li>
<li>Srirama, P. K., Wallis, C. D., Lee, D., Wexler, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+extra-thoracic+airways+and+deposited+particles+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22J+Aerosol+Sci%22%5BJournal%5D)">Imaging extra-thoracic airways and deposited particles in laboratory animals.</a> J Aerosol Sci. 45, 40-49 (2012).</li>
<li>Thomas, S. M., Bednarek, J., Janssen, W. J., Hume, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air-inflation+of+murine+lungs+with+vascular+perfusion-fixation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Air-inflation of murine lungs with vascular perfusion-fixation.</a> J Vis Exp. 168, e62215(2021).</li>
<li>Bankhead, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((QuPath%3A+Open+source+software+for+digital+pathology+image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">QuPath: Open source software for digital pathology image analysis.</a> Sci Rep. 7 (1), 16878(2017).</li>
<li>Davenport, M. L., Sherrill, T. P., Blackwell, T. S., Edmonds, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+inflation+of+the+mouse+lung+for+tumor+histology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Perfusion and inflation of the mouse lung for tumor histology.</a> J Vis Exp. 162, e60605(2020).</li>
<li>Hsia, C. C. W., Hyde, D. M., Ochs, M., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+official+research+policy+statement+of+the+American+Thoracic+Society%2FEuropean+Respiratory+Society%3A+Standards+for+quantitative+assessment+of+lung+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">An official research policy statement of the American Thoracic Society/European Respiratory Society: Standards for quantitative assessment of lung structure.</a> Am J Respir Crit Care Med. 181 (4), 394-418 (2010).</li>
<li>Gil, J., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+lining+of+bronchioles+after+perfusion-fixation+of+rat+lungs+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Extracellular lining of bronchioles after perfusion-fixation of rat lungs for electron microscopy.</a> Anat Rec. 169 (2), 185-199 (1971).</li>
<li>Bachofen, H., Ammann, A., Wangensteen, D., Weibel, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+fixation+of+lungs+for+structure-function+analysis%3A+credits+and+limitations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Appl+Physiol+Respir+Environ+Exerc+Physiol%22%5BJournal%5D)">Perfusion fixation of lungs for structure-function analysis: credits and limitations.</a> J Appl Physiol Respir Environ Exerc Physiol. 53 (2), 528-533 (1982).</li>
<li>Evans, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polymeric+mucin+Muc5ac+is+required+for+allergic+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The polymeric mucin Muc5ac is required for allergic airway hyperreactivity.</a> Nat Commun. 6, 6281(2015).</li>
<li>Galati, D. F., Asai, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence microscopy.</a> Curr Protoc. 3 (8), e842(2023).</li>
<li>Hickey, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy-An+outline+of+hardware%2C+biological+handling%2C+and+fluorophore+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy-An outline of hardware, biological handling, and fluorophore considerations.</a> Cells. 11 (1), 35(2021).</li>
<li>Risling, T. E., Caulkett, N. A., Florence, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-drop+anesthesia+for+small+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Can+Vet+J%22%5BJournal%5D)">Open-drop anesthesia for small laboratory animals.</a> Can Vet J. 53 (3), 299-302 (2012).</li>
<li>Bodnar, M. J., Ratuski, A. S., Weary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+isoflurane+anesthesia+using+the+drop+method%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Mouse isoflurane anesthesia using the drop method.</a> Lab Anim. 57 (6), 623-630 (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>18 g, 1 1/2 針 (305185)</td><td>Fisher</td><td>305185</td><td></td></tr><tr><td>1 L&nbsp;スクリュートップジャー&nbsp;(ナルジーン)</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>11-823-33</td><td></td></tr><tr><td>エアタイトバルク非滅菌シリンジ 10 mL ルアーロック</td><td>フィッシャー</td><td>14-817-175</td><td></td></tr><tr><td>AnaSed 注射 (キシラジン滅菌溶液)</td><td>Akorn</td><td>59399-110-20</td><td></td></tr><tr><td>アニマルフリーブロッカーおよび希釈剤、R.T.U.</td><td>ベクトル</td><td>SP-5035-100</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard Winged Shielded IV カテーテル BD Vialon カテーテル 材料 18 G x 1.88 インチ</td><td>BD</td><td>381547</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen 精製ラット 抗マウス CD16/CD32 (マウス BD FC ブロック &貿易;)</td><td>BD</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker オレンジ CMRA 染料</td><td>フィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>NC0873640</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Labviva</td><td>75003</td><td></td></tr><tr><td>Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3&Delta;&nbsp;</td><td>BEI Resources</td><td>NR-166</td><td></td></tr><tr><td>Corning 70 ミクロン ストレーナー</td><td>VWR</td><td>10054-456</td><td></td></tr><tr><td>EpCAM AlexaFluor647 モノクローナル抗体</td><td>Biolegend</td><td>118211</td><td></td></tr><tr><td>Exel International HYpodermic Needles 30 G x 1/2"</td> <td>Labviva</td><td>EN3012</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand 滅菌シリンジ (1mL、Leur Slip)</td><td>Fisher</td><td>14-955-462</td><td></td></tr><tr><td>グルコース・モノハイドレート</td><td>アゼル・サイエンティフィック&nbsp;</td><td>ES17530-500G</td><td></td></tr><tr><td>高真空グリース</td><td>VWR</td><td>59344-055</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342 溶液 20 mM (5 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>イソフルラン USP</td><td>Covetrus</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>ケタミン塩酸塩</td><td>Dechra</td><td>1000001250</td><td></td></tr><tr><td>KIMWIPES 繊細なタスクワイパー (4.4 インチ x 8.4 インチ)</td> <td>VWR</td><td>21905-026</td><td></td></tr><tr><td>レクサーベビーはさみ</td><td>FST14078-10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マイクロアドソン鉗子</td><td>FST11018-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>中性緩衝ホルマリン(10%)(アゼルサイエンティフィック)</td><td>フィ</td><td>ッシャー22-026-350</td><td></td></tr><tr><td>ヌンクEasYFlask組織培養フラスコ、T75、フィルターキャップ</td><td>VWR</td><td>15708-134</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>VWR45000-446</td><td></td><td></td></tr>ピー<tr><td>ルアウェイ埋め込み金型</td><td>Sigma</td><td>E6032-1CS</td><td></td></tr><tr><td>QuPath 0.5.1 ソフトウェア</td><td>オープンソース</td><td>https://qupath.github.io/</td><td></td></tr> <tr><td>Silk 縫合糸 糸サイズ 3/0</td><td>FST</td><td>18020-30</td><td></td></tr><tr><td>SlidesMicro Slides Superfrost Plus&nbsp;</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>SlowFade ガラス ソフトセット 退色防止封入剤 (2 mL)</td><td>ThermoFischer</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>スクロー</td>ス <td>シグマ</td><td>S0389-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. コンパウンド、Sakura Finetek</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>ThermoFischer</td><td>J20605.AP</td><td></td></tr><tr><td>Vector Laboratories ImmEDGE 疎水性バリア ペン セット 2 個入り</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9545623</td><td></td></tr><tr><td>VWR マイクロ カバー メガネ、長方形 (24 mm x 40 mm #1.5)</td><td>VWR</td><td>48393-230</td><td></td></tr><tr><td>白いプラスチック ワイヤー メッシュ</td><td>MAPORCH</td><td>789862904922</td><td></td></tr><tr><td>酵母抽出</td><td></td>物 <td>Fisher BP9727-500</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss AxioScan 7&nbsp;</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/imaging-systems/axioscan-for-biology.html</td><td>マルチチャンネル蛍光顕微鏡</td></tr><tr><td>ZEN 3.7 Software</td><td>Carl Zeiss Microscopy GmbH</td><td>https://www.zeiss.com/microscopy/us/products/software/zeiss-zen.html</td><td>顕微鏡ソフトウェア</td></tr></tbody></table>

気道内の真菌胞子の空間動態を保存するマウス肺の効率的なイメージング法

Efficient Method for Imaging Murine Lungs that Preserves Spatial Dynamics of Fungal Spores in the Airways

この方法では、最終的に生理学的な空気膨張を使用してマウスの肺の免疫蛍光画像を生成し、気道を乱さないようにします。重要なのは、途中の複数のチェックポイントによって、プロトコルのコンポーネントが正常に実行されたことを確認することです。接種中は、マウスの後胸壁に液体が気道に入ったことを示す「パチパチ音」を感じることで、接種物が吸引されたことを確認することが重要です。パチパチという音の感覚がない場合は、マウスが接種物を飲み込んだ可能性があります。マウスの肺にPBSを投与すると、肺に白い斑点が生じ、続いて肺全体が完全に白くなるはずです(図2A)。不完全な美白がある場合、その後のホルマリン灌流は肺実質のすべての領域に到達しません(図2B)。肺を空気で膨らませるとき、肺は生理学的なサイズに達するまでゆっくりと膨張する必要があります。気管縫合糸を結んで肺内の空気を確保した後、肺のサイズが収縮してはいけません。もしそうなら、手術中に肺が穿刺された可能性が高いです。
ここでは、空気膨張肺とホルマリン液体膨張肺の両方で、 標識されたCoccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ 胞子(緑)およびEpCAM+柱状細気管支上皮(マゼンタ)を有する切片の代表的な画像を示します(それぞれ図3A、B )。これらの胞子は、主に遠位細気管支内と、それらの遠位細気管支のすぐ隣の肺胞腔(おそらく肺胞管内)に蓄積します。空気膨張式固定液を灌流した肺には、細気管支内に頻繁に出現し、細気管支に近い場所に集まる胞子が含まれています(図3A)のは、胞子が細気管支上皮からわずかに分散して現れる液体固定剤(図3B)ではありません。QuPath空間解析では、個々の胞子から最も近いEpCAM+細気管支上皮までの距離を測定し、細気管支から離れてより遠位の肺胞空間への胞子の分散レベルを示します。液体の膨張は、生理的な空気の膨張と比較して、胞子を細気管支からさらに離して分散させることを示しています(図4A、B)。空気膨張血管灌流は、遠位細気管支におけるこれらの胞子の自然な位置を維持し、気管内固定剤注入によるこれらの胞子のより遠位の肺胞腔への人工的な分散を防ぎます。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig02.jpg"> 
図2:肺灌流成功の適応症 (A)灌流に成功した肺は完全に白くなります。(B)不完全に灌流された肺は、外観がピンク色またはまだらに見えます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig03.jpg"> 
図3:空気で膨らませたホルマリン灌流肺とホルマリン膨らませた肺の胞子分布の代表的な画像。細胞内蛍光胞子(緑)は、(A)ホルマリンで膨らんだ肺よりも(A)空気で膨らんだ肺で、EpCAM+細気管支上皮(マゼンタ)に近接して分布していることが見られます。画像は、各治療群のマウスの左葉の後面から深さ1.2mmの切片から、マルチチャンネル蛍光顕微鏡で20倍の倍率で取得し、顕微鏡ソフトウェアを使用してタイルをステッチしました。スケールバー = 800 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67556/67556fig04.jpg"> 
図4:空気膨張した肺とホルマリン膨張した胞子治療肺の胞子距離(mm)から細気管支上皮までの距離(mm)の比較。 治療群ごとに3匹のマウスから採取した肺を、1 x 106 Coccidioides posadasii cts2/ard1/cts3Δ arthroconidiaの接種後1.5時間採取、処理、画像化しました。左葉の後面から0.8 mm、1.2 mm、1.6 mm、2.0 mmの地点でマウス1匹あたり4切片をサンプリングし、染色し、マルチチャンネル蛍光顕微鏡でイメージングしました。各グループのすべての胞子をQuPathで検出し、空間解析して、(A)最も近いEpCAM+柱状細気管支上皮までの距離を決定し、(B)中央値と95%信頼区間をマイクロメートル単位で表示しました。空気膨張胞子、n = 11,673。液体膨張胞子、n = 9,837。マン・ホイットニーのt検定は正規性がないために実施され、p&lt;0.0001でした。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67556/67556fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Fungi infect humans when environmental spores are inhaled into the lungs. The lung is a heterogeneous organ. Conducting airways, including bronchi and ...

efficient-method-for-imaging-murine-lungs-that-preserves-spatial

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

我々は、彼らが病原体を貪食や好中球細胞外トラップ（NETS）を生成しながら、感染肺における好中球顆粒球の動態の観察のために、2光子顕微鏡を使用する方法を、示しています。...

2光子顕微鏡を用いて感染肺における好中球による貪食とNET -形成の直接観察

このビデオでは、アガロースを使用してインフレーションを行い、がん細胞と間質細胞との相互作用を研究するためのex...

全肺アガロースインフレーション:ex vivoライブイメージングのための肺の準備方法

マウスの蛍光レポーターを利用して、肺転移内の腫瘍細胞間質相互作用のex...

ex vivoでのライブ肺転移のイメージングとその微小環境

このプロトコルは、真空安定化イメージングウィンドウを使用して、無傷の肺の長期高解像度シングルセルイメージングをリアルタイムで行うための多光子顕微鏡の使用を説明しています。...

真空安定化撮像窓と肺における長期高分解能生体顕微鏡

非侵襲的なマルチ モーダル イメージング ブレオマイシンの二重気管内投与によるマウス肺線維症モデルの縦断的評価のマイクロ CT と蛍光分子トモグラフィを用いた手法について述べる.

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

マイコバクテリウムの結核(結核) レポーター酵素蛍光 (REF)...

レポーター酵素蛍光を用いたマウスにおける結核菌をイメージング

ゴモリの変更された methanamine 銀染色組織切片の定量化による侵襲性アスペルギルス症マウスにおける肺真菌負担を決定するプロトコルについて述べる。このメソッドの使用は肺真菌 DNA の定量的 PCR...

アスペルギルス症では実験的肺真菌負担を決定する組織の定量化

本研究ではマウスの気管粘膜のインフルエンザ ウイルスに感染後 2...

イメージング 2 光子生体顕微鏡を用いたインフルエンザ ウイルス感染症の中に気管粘膜の細胞相互作用

本稿では、二相様式放射性核種イメージングを利用したマウスの生体内における気道粘膜クリアランス(MCC)を評価するためのプロトコルについて説明する。このプロトコルは、デュアルSPECT/CTシステムでマウス全身(MWB)コリメータを使用した単一光子放射コンピュータ断層撮影(SPECT)およびコンピュータ断層撮影プロトコル用に設計されています。...

マウスにおける粘膜クリアランスのインビボ評価

マウスの気道における アスペルギルス・フミガトゥス...

全実装光学的にクリアされたマウス肺における アスペルギルス・フミガトゥス ・コニディア分布の共焦点レーザー走査顕微鏡ベースの定量分析

ここでは、減衰BSL-2承認の 結核菌...

初期血管内感染中のマウス肺における減弱型自生 性結核菌 のインバイタルイメージング

学ぶマウス肺の気道内容物を保存する効率的なイメージング法。真菌胞子の自然な位置を維持し、蛍光顕微鏡で詳細な空間分析を可能にする。Coccidioides posadasiiを用いた肺感染モデルで免疫応答を研究する。

気道内の真菌胞子の空間動態を保存するマウス肺の効率的なイメージング法

さらに動画を探す