March 28th, 2025
この論文では、脱細胞化および再細胞化法を使用してバイオエンジニアリングされたマウス肺を作成する方法を説明します。また、その後の同所性肺移植についても詳しく説明しています。
人間サイズの臓器をバイオエンジニアリングするには大量のリソースが必要であり、多くの場合、学術研究室の能力を超えます。反復プロトコル開発のコストを削減することで、この分野の研究の進歩が加速します。この研究の目的は、マウス心肺ブロックを使用した肺生物工学の標準化されたプロトコルを提供することです。どの細胞が臓器バイオエンジニアリングに適しているのか、そしてそれらの細胞を臓器バイオリアクター培養にどのように組み込むべきかはまだ不明です。スケーラブルで再現性のあるプロトコルを確立するには、複数の種類の細胞と条件を比較する必要があります。
マウスは小さくて扱いやすい実験動物です。ただし、それらは小さいですが、肺の基本的な構造は哺乳類間で似ています。この小さなプラットフォームでプロトコルを最適化することで、動物のサイズに応じて最適化された結果を乗算するだけで、レーザー動物モデルをスケールアップできます。このマウスサイズの肺バイオエンジニアリングプラットフォームにより、研究者は幹細胞を効率的にテストできます。これらの遺伝子組み換え細胞は、肺全体の工学に使用するには貴重または高価になる可能性があります。さらに、患者由来の細胞を使用して、in vitroで疾患モデルを作成することもできます。
現在の取り組みには、複数の種類の操作幹細胞と前駆細胞をテストして、肺の生物工学に必要な増殖能と異なる能力を把握することが含まれます。適切な細胞が特定されれば、この研究はブタなどのより大きな動物モデルに拡大されます。
[ナレーター]まず、安楽死させたマウスを手術台の上に仰臥位に置き、手足を固定します。70%エタノールを胸部と腹部表面に均一にスプレーして殺菌します。次に、ステンレスはさみを使用して、首まで伸びる正中線に沿って腹腔を開き、胸骨を分割します。胸壁から横隔膜を切除します。腹側の胸壁を切断して胸腔を露出させ、胸腺を取り除きます。4/0シルク縫合糸を使用して、下大静脈と右上大静脈をレゲートします。腹部大動脈をステンレスはさみで切り、排水します。27ゲージの針を備えた5ミリリットルの滅菌注射器を使用して、心室壁に穴を開けて3ミリリットルの滅菌PBSを右心室に注入します。デュモン鉗子を使用して、主肺動脈の周りに4/0シルク縫合糸をループさせます。次に、バネハサミを使用して肺動脈弁の下に2ミリメートルの窓を切り、右心室壁にアクセスします。肺動脈カテーテルを窓から挿入し、事前にループされた 4/0 シルク縫合糸で固定します。5ミリリットルの注射器を使用して、肺動脈カテーテルを通して2ミリリットルのPBSをゆっくりと注入します。気管カテーテルで気管をカニューレ挿入し、4/0シルク縫合糸で所定の位置に結び付けます。次に、空の 5 ミリリットルの注射器を使用して、気管カテーテルから 2 ミリリットルの空気をゆっくりと注入します。肺から空気が漏れないように、空気を10秒間保持します。心臓と肺のエンドブロックを取り外します。次に、切除した心肺ブロックを、肺の脱細胞化のために、脱イオン水を含む直径10センチメートルのプラスチック製ペトリ皿に移します。ブロックを摂氏4度で1時間インキュベートします。インキュベーション後、5ミリリットルの注射器を使用して、2ミリリットルの滅菌脱イオン水を気管カテーテルに3回注入します。各注射の後に一時停止して、肺が反動するときに液体が排出されるのを待ちます。同様に、肺動脈カテーテルから2ミリリットルの水を注入します。2ミリリットルの0.1%Triton X-100溶液を気管カテーテルと肺動脈カテーテルの両方に注入します。心肺ブロックをペトリ皿に移し、摂氏4度のTriton X-100溶液中で一晩静的にインキュベートします。翌日、トリトンX-100溶液を肺から除去するために、気管カテーテルと肺動脈カテーテルに2ミリリットルの脱イオン水を注入し、2ミリリットルの2%デオキシコール酸塩溶液でこれらを繰り返します。肺からデオキシコール酸塩溶液を除去した後、2ミリリットルの1モル塩化ナトリウム溶液を気管カテーテルと肺動脈カテーテルの両方に注入します。心肺ブロックを1時間インキュベートします。脱イオン水で塩化ナトリウム溶液を除去した後、2ミリリットルのDNase I作業溶液を気管および肺動脈カテーテルに注入します。心肺ブロックを1時間インキュベートします。滅菌PBSを気管および肺動脈カテーテルに注入して、DNase I溶液を除去します。脱細胞化後、肺の端が白く透明であることを確認します。70ミリリットルの内皮細胞増殖培地2またはEGM-2培地をガラスキャニスターに加え、シリコンストッパーをキャニスターの上に置いて密封します。シリコンストッパー、ガラスキャニスター、チューブ付きGL45スクリューキャップ、250ミリリットルのオートクレーブ可能なガラス瓶、および3方向活栓を使用してルアーフィッティング付きのL / S 14チューブを組み立てます。GL45スクリューキャップのシリコンセプタムに20ゲージの針を挿入します。活栓1と3に接続された10ミリリットルのシリンジを使用して、チューブA、B、およびCに培地を充填します。脱細胞化心肺ブロックの肺動脈カテーテルをルアーフィッティングを介してチューブCに取り付けます。カテーテルまたはチューブ内に気泡が存在しないことを確認します。 内皮細胞の重力駆動注射の場合は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を含む細胞リザーバーをマグネチックスターラーに置き、リザーバーが臓器室から30センチメートル上にあることを確認します。マグネチックスターラーを120RPMの速度でオンにします。活栓1と2を開いて、細胞懸濁液がチューブA、チューブC、および肺動脈カテーテルを介して脱細胞足場に流れ込むようにします。臓器培養の灌流のために、臓器室を二酸化炭素インキュベーターに入れます。脈動ポンプに接続されたポンプヘッドにチューブBを取り付けます。インキュベーターのガラスドアを閉めます。チューブがドアとゴム製シールの間に適切に配置されていることを確認してください。脱細胞化した足場を摂氏37度で3時間インキュベートし、内皮細胞が足場内に沈殿できるようにします。ポンプを6RPMの速度で始動し、L/S 14チューブを使用して毎分2ミリリットルの培地灌流を行います。中地灌流により脱細胞肺がわずかに拡張しているのを観察します。次に、インキュベーターのドアを閉めます。メディア交換を行うには、ポンプドライブを停止します。50ミリリットルの滅菌シリンジを活栓3に取り付け、チャンバーから50ミリリットルの培地を取り出します。別の50ミリリットルの滅菌シリンジに、50ミリリットルの予熱培地を入れます。溶液をガラスキャニスターに注入し、活栓3を介して培地をチャンバーに移し、活栓が適切に切り替わることを確認します。拍動ポンプを再起動します。灌流臓器培養の2日後に再集集した心肺ブロックを採取します。マウスの肺は脱細胞後に白く半透明に見え、肺全体の構造を維持しながら細胞成分が除去されたことを示しています。脱細胞化マウス肺の組織学的分析により、細胞成分が残っていない無傷の肺胞構造が明らかになりました。灌流ベースのバイオリアクター培養の2日後、7つのHUVECの3倍の10乗の肺を再細胞化したマウスは、HUVECの均一な分布を示しました。HUVEC は末梢肺胞領域に移動し、再集形肺で観察されるように毛細血管のようなネットワークを形成しました。
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この研究は、脱細胞化および再細胞化技術を通じてマウス肺をバイオエンジニアリングするための標準化されたプロトコルを提示します。スケーラブルで再現可能な結果を得るための方法を最適化し、器官バイオエンジニアリングの研究を促進することを目的としています。
Bioengineered lung transplantation using decellularized mouse lungs and primary human endothelial cells addresses a critical bottleneck in organ bioengineering: scalable, cost-effective experimental platforms for early-stage protocol optimization. This approach enables rapid, resource-efficient hypothesis testing for cell integration and scaffold compatibility, directly impacting target validation and mechanistic de-risking in regenerative medicine pipelines. The platform's flexibility supports iterative discovery and portfolio triage for cell therapy and organ replacement strategies.
This mouse-scale bioengineering protocol fits at the interface of early discovery, target validation, and preclinical model development, enabling rapid iteration before resource-intensive scale-up.