Name: 犬の鼻免疫微小環境のサンプリングのための生理食塩水洗浄液 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 35 s
Description: 学ぶ生理食塩水洗浄法による犬の鼻免疫微小環境のサンプリング技術。放射線治療中の免疫応答を時系列的に解析し、がん治療効果向上に貢献する非侵襲的手法を習得する。

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<ol><li>Cohn, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+nasal+disease%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin%3A+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Canine nasal disease: An update.</a> Vet Clin: Small Anim Pract. 50 (2), 359-374 (2020).</li>
<li>Mortier, J., Blackwood, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+of+nasal+tumours+in+dogs%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Treatment of nasal tumours in dogs: A review.</a> J Small Anim Pract. 61 (7), 404-415 (2020).</li>
<li>Plickert, H., Tichy, A., Hirt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+canine+nasal+discharge+related+to+intranasal+diseases%3A+A+retrospective+study+of+105+cases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Characteristics of canine nasal discharge related to intranasal diseases: A retrospective study of 105 cases.</a> J Small Anim Pract. 55 (3), 145-152 (2014).</li>
<li>Windsor, R. C., Johnson, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+chronic+inflammatory+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Tech+Small+Anim+Practice%22%5BJournal%5D)">Canine chronic inflammatory rhinitis.</a> Clin Tech Small Anim Practice. 21 (2), 76-81 (2006).</li>
<li>Van Pelt, D. R., Mckiernan, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+and+treatment+of+canine+rhinitis%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis and treatment of canine rhinitis.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 24 (5), 789-806 (1994).</li>
<li>Hazuchova, K., Neiger, R., Stengel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topical+treatment+of+mycotic+rhinitis-rhinosinusitis+in+dogs+with+meticulous+debridement+and+1%25+clotrimazole+cream%3A+64+cases+%282007-2014%29%5BTitle%5D)+AND+%22JAVMA%22%5BJournal%5D)">Topical treatment of mycotic rhinitis-rhinosinusitis in dogs with meticulous debridement and 1% clotrimazole cream: 64 cases (2007-2014).</a> JAVMA. 250 (3), 309-315 (2017).</li>
<li>Lobetti, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+lymphoplasmacytic+rhinitis+in+33+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22JS+Afr+Vet+Assoc%22%5BJournal%5D)">Idiopathic lymphoplasmacytic rhinitis in 33 dogs.</a> JS Afr Vet Assoc. 85 (1), 1-5 (2014).</li>
<li>Ashbaugh, E. A., Mckiernan, B. C., Miller, C. J., Powers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nasal+hydropulsion%3A+A+novel+tumor+biopsy+technique%5BTitle%5D)+AND+%22JAAHA%22%5BJournal%5D)">Nasal hydropulsion: A novel tumor biopsy technique.</a> JAAHA. 47 (5), 312-316 (2011).</li>
<li>Wheat, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+immune+and+microbiological+responses+to+mucosal+administration+of+a+liposome-tlr+agonist+immunotherapeutic+in+dogs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Local immune and microbiological responses to mucosal administration of a liposome-tlr agonist immunotherapeutic in dogs.</a> BMC Vet Res. 15 (1), 330(2019).</li>
<li>Darragh, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elective+nodal+irradiation+mitigates+local+and+systemic+immunity+generated+by+combination+radiation+and+immunotherapy+in+head+and+neck+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Elective nodal irradiation mitigates local and systemic immunity generated by combination radiation and immunotherapy in head and neck tumors.</a> Nat Commun. 13 (1), 7015(2022).</li>
<li>Pinard, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+lymphocyte-specific+programmed+cell+death+protein+1+receptor+expression+and+cytokines+in+blood+and+urine+in+canine+urothelial+carcinoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Comp+Oncol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of lymphocyte-specific programmed cell death protein 1 receptor expression and cytokines in blood and urine in canine urothelial carcinoma patients.</a> Vet Comp Oncol. 20 (2), 427-436 (2022).</li>
<li>Choi, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+canine+pd-1%2Fpd-l1+specific+monoclonal+antibodies+and+amplification+of+canine+t+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of canine pd-1/pd-l1 specific monoclonal antibodies and amplification of canine t cell function.</a> PLoS One. 15 (7), e0235518(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL&nbsp;チューブ</td><td>Eppendorf</td><td>05-402</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro;L ピペット</td><td>VWR</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>20 mL シリンジ</td><td>VWR</td><td>BD302830</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>70 & micro;m セルストレーナー</td><td>Fisherbrand</td><td>22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>8FR 滅菌赤色ゴムカテーテル</td><td>Med Vet International</td><td>50-252-2428</td><td></td></tr><tr><td>ACK 溶解バッファー</td><td>Gibco</td><td>A1049201</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td></td></tr>生理<tr><td>食塩水 (0.9%)</td> <td>Vetivex</td><td>17033-492-01</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>〒10153-838</td><td></td></tr></tbody></table>

犬の鼻免疫微小環境のサンプリングのための生理食塩水洗浄液

Saline Lavage for Sampling of the Canine Nasal Immune Microenvironment

この鼻洗浄法では、採取したサンプルはわずかに濁って見え、チューブが渦巻くと細胞の破片や粘液の破片が見える可能性があります。洗浄手順が誤って出血を誘発し、サンプルが赤みを帯びている場合、サンプルは末梢血で汚染されていると見なされます。注入された生理食塩水の一部は手術中に失われますが、注入された生理食塩水が鼻孔からチューブに逆流しない場合は、陰性の洗浄が考慮されます。考えられる原因は、ヘッドが効果的に逆流できるように十分に下向きに傾いていない、サンプルが反対側の鼻孔から尾側または横方向に排出されている、または赤いゴム製のカテーテルが注射器にしっかりと固定されておらず、生理食塩水が接続点から外側に漏れている可能性があります。
鼻がんの犬から鼻洗浄サンプルを成功裏に収集した場合、1 × 10 6-200 × 106 6 の範囲の有核細胞数が予想され、75-96% の生細胞が存在します。あるいは、鼻腔が健康で炎症を起こしていない犬から鼻洗浄サンプルを成功裏に収集した場合、細胞数は7 × 105-2 × 106の範囲にあり、6〜16%の生細胞があります。腫瘍発生犬の鼻洗浄サンプリングから得られた細胞標本の代表的な画像を図2に示します。さらに、健康な犬と腫瘍を抱えた犬の鼻洗浄サンプルから分析した細胞集団のフローサイトメトリー評価を図3に示します。これらの範囲よりも低い細胞数と生存率が、鼻洗浄手順とサンプル収集が失敗したことを示していると予想される。表1は、実施された処置の数、犬の数、鼻腔の状態(健康または腫瘍発生)、有核細胞数の収量、処置のために得られた細胞の生存率、および洗浄サンプルがダウンストリーム分析の成功または失敗と見なされたかどうかに関して、著者らが実施した鼻洗浄技術の結果をまとめたものです。表1に含まれる鼻洗浄サンプルを用いて行った実験の目的上、最小細胞数収量150,000を鼻洗浄サンプル採取の成功とみなした。
この鼻洗浄技術では、滅菌された0.9%生理食塩水を使用して細胞を収集します。あるいは、ハルトマンの解決策(乳酸リンガーの解決策)を検討することもできます。ただし、生理食塩水またはハルトマン溶液で採取したサンプルは、目的の細胞について同等の生存率と結果を確認するためにテストする必要があります。さらに、腫瘍を持たない犬に赤いゴム製のカテーテルを使用する代わりに、フォーリーカテーテルで鼻洗浄を行うこともできます。ここで紹介した鼻洗浄技術では使用されていませんが、フォーリーカテーテルを使用すると、カテーテルの先端でバルーンを膨らませ、鼻腔を閉塞し、尾側の水分の損失を防ぐことができます。また、ここで紹介した鼻洗浄処理アプローチでは検証されていないが、鼻洗浄サンプルにヒアルロニダーゼを添加すると、鼻洗浄サンプルに集まった粘液が分解され、より多くの細胞が分析のために解放されると考えることができる。これはまた、鼻洗浄処理手順にヒアルロニダーゼを追加することで結果が変わらないように最適化する必要があります。
イヌがんの臨床試験に登録されたイヌで実施された成功した鼻洗浄手順から得られた公開結果を 図310に示します。 図3 に示されている結果は、腫瘍が単独でまたは局所頸部リンパ節照射と組み合わせて照射された副鼻腔腫瘍の犬の局所免疫微小環境に対する選択的リンパ節照射の影響を調査した研究からのものです。経鼻洗浄剤を用いた臨床試験におけるイヌの鼻腔の連続サンプリングを通じて、採取した細胞のフローサイトメトリー解析により、放射線治療の最終日にエフェクターT細胞の集団が有意に減少したことが明らかになりました。これは、腫瘍を標的とした放射線療法を受けたイヌと比較して、副鼻腔腫瘍と同時に照射され、所属リンパ節が温存されたイヌと比較して明らかになりました。これは、洗浄液を使用して鼻腔を連続的にサンプリングして、さまざまなポイントやさまざまな治療条件での細胞集団の変化を調査することの有用性を示しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig01.jpg"> 
図1:鼻洗浄法の概略図。 麻酔をかけた犬の鼻腔に、赤いゴム製のカテーテルを使用して、温められた滅菌生理食塩水を注入します。鼻洗浄液は、鼻から排出されるときにチューブに集められます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig02.jpg"> 
図2:鼻腫瘍のある犬から採取した鼻洗浄サンプルの細胞組成。 鼻洗浄サンプリングから得られた細胞標本の代表画像(500倍倍、Modified Wright-Gimsa染色)。好中球(矢印)が優勢な細胞であり、いくつかの扁平上皮細胞(矢印)と小さな成熟リンパ球(四角いボックスで強調表示)も存在します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2.jpg"> 
図 3.健康な犬と腫瘍を抱えた犬から採取した鼻洗浄サンプルのフローサイトメトリー分析。 健康なイヌ(青、n = 3)と副鼻腔がんの担発犬(赤、n = 4)の生細胞、免疫細胞、好中球の存在量の比較。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67577/67577fig04.jpg"> 
図4:選択的リンパ節照射(ENI)が局所免疫微小環境に与える影響を調査する臨床試験に登録された犬の鼻洗浄から採取した細胞のフローサイトメトリー解析。 経鼻洗浄サンプルからのCD4(CD5+CD4+)およびCD8(CD5+CD8+)T細胞の定量。腫瘍照射と同時にENIで治療されたイヌ(n = 3)は、腫瘍のみを標的とした放射線で治療されたイヌ(n = 3)と比較して、放射線の最終日(3日目)にエフェクターCD4およびCD8T細胞が有意に減少しました。この図は、Darragh et al.10から修正されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67577/67577fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>健康 (n=3)</td>
			<td>腫瘍担体 (n= 19)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>実行された手順の数</td>
			<td>3</td>
			<td>80</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>セル数</td>
			<td>0.7 x 106 - 2.8 x 106</td>
			<td>1.6 x 106 - 210 x 106;中央値: 8.7 x 106</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>細胞生存率</td>
			<td>6.3 - 15.9%</td>
			<td>75% - 96%;中央値:87%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>成功率</td>
			<td>100%</td>
			<td>98.80%</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:実施された経鼻洗浄手順の要約と得られたサンプルの細胞特性。

Evaluating the local immune microenvironment of the canine nasal cavity can be important for investigating normal tissue health and disease conditions, ...

saline-lavage-for-sampling-of-the-canine-nasal-immune-microenvironment

Research

JoVE Journal

Medicine

医学

我々は低圧吸引を使用して気管支鏡検査および気管支肺胞洗浄のための研究手法を説明します。技術が肺の気管支表面から免疫細胞を採取するために使用される。局所麻酔薬と軽度の意識下鎮静（ミダゾラム）が使用されます。被験者はよく手順を容認し、最小限の副作用を経験する。...

研究のための気管支肺胞洗浄（BAL）、適切なサンプル利回りの取得

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アウェイクマウスに対する中枢神経系治療薬の経鼻投与

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鼻粘膜および気管支の流体の吸収: 人間の呼吸器粘膜とサンプル室加工高精度サンプリング

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学ぶ生理食塩水洗浄法による犬の鼻免疫微小環境のサンプリング技術。放射線治療中の免疫応答を時系列的に解析し、がん治療効果向上に貢献する非侵襲的手法を習得する。

犬の鼻免疫微小環境のサンプリングのための生理食塩水洗浄液

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