Name: 細胞外フラックスバイオアナライザーを用いた慢性エタノール曝露による肺胞マクロファージの燃料源としてのグルタミンの評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶ細胞外フラックスバイオアナライザーを用いた肺胞マクロファージのミトコンドリア呼吸測定法。慢性エタノール曝露によるグルタミン代謝変化と免疫機能への影響を評価する再現性の高いプロトコルを解説します。

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<meta charset="utf8"></head><body>エタノールはグルタミン依存性呼吸に移行することによりAM生体エネルギーを損なう

<ol><li>2021 National Survey on Drug Use and Health (NSDUH). Table 5.6A - Alcohol Use Disorder in Past Year: Among People Aged 12 or Older; by Age Group and Demographic Characteristics, Numbers in Thousands, 2021. , Substance Abuse and Mental Health Services Administration (SAMHSA). At
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<li>Winnica, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+differences+in+the+airway+epithelium+of+lean+versus+obese+asthmatics+are+driven+by+nitric+oxide+and+reflected+in+circulating+platelets%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic differences in the airway epithelium of lean versus obese asthmatics are driven by nitric oxide and reflected in circulating platelets.</a> Antioxid Redox Signal. 31 (10), 673-686 (2019).</li>
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<li>Chacko, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+defining+distinct+bioenergetic+profiles+in+platelets%2C+lymphocytes%2C+monocytes%2C+and+neutrophils%2C+and+the+oxidative+burst+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Methods for defining distinct bioenergetic profiles in platelets, lymphocytes, monocytes, and neutrophils, and the oxidative burst from human blood.</a> Lab Invest. 93 (6), 690-700 (2013).</li>
<li>Tyrrell, D. J., Bharadwaj, M. S., Jorgensen, M. J., Register, T. C., Molina, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+cell+respirometry+is+associated+with+skeletal+and+cardiac+muscle+bioenergetics%3A+Implications+for+a+minimally+invasive+biomarker+of+mitochondrial+health%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Blood cell respirometry is associated with skeletal and cardiac muscle bioenergetics: Implications for a minimally invasive biomarker of mitochondrial health.</a> Redox Biol. 10, 65-77 (2016).</li>
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<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> J Vis Exp. 46, e2511(2010).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>15mLコニカルチューブ&nbsp;</td><td>VWRインターナショナル株式会社</td><td>21008-670</td><td>ミトコンドリア関連試薬のストック濃度の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>2-メルカプトエタノール&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>M6250</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr><tr><td>セルスクレーパー</td><td>Dot Scientific, Inc.</td><td>70-1180</td><td>T-75フラスコからMH-S細胞を掻き取るために使用されます。</td></tr><tr><td>Countess 3 FL Instrument: セルカウンター</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー</td><td>AMQAF2000</td><td>実験のためにプレートするMH-S細胞の数を数えるために使用されます。</td></tr><tr><td>D-グルコース&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>G8270</td><td>細胞外フラックスベース培地に使用されます。</td></tr><tr><td>エタノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィックカンパニー</td><td>4355720</td><td>MH-S細胞の実験的治療。</td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>Sciencell Research Laboratories</td><td>500</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr><tr><td>ゲンタマイシン</td><td>シグマアルドリッチ(株)</td><td>G1397</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>35050061</td><td>細胞外フラックスベース培地に使用されます。</td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.2.3</td><td>GraphPadソフトウェア</td><td>N/A</td><td>統計解析用ソフトウェア。購入後、https://www.graphpad.com/features でダウンロード可能。</td></tr><tr><td>MH-S細胞</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-2019</td><td>マウス肺胞マクロファージ細胞株。</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ&nbsp;</td><td>USAサイエンティフィック社</td><td>4036-3212</td><td>ミトコンドリア関連試薬の使用濃度の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>Microsoft 365 Excel:データ</td>整理とミトコンドリア生体エネルギー計算のためのコンピュータスプレッドシートプログラム<td>Microsoft</td><td>N / A</td><td>ソフトウェア。購入後、https://www.microsoft.com/en-us/microsoft-365/excel でダウンロード可能。</td></tr><tr><td>ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック・カンパニー</td><td>15140122</td><td>MH-S細胞の培養に使用されます。</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>VWRインターナショナル株式会社</td><td>45000-446</td><td>MH-S細胞の洗浄に使用されます。</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>VWRインターナショナル株式会社</td><td>45000-396</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr><tr>Seahorse Wave Pro Software: <td>Agilent Technologies, Inc.</td> の<td>アッセイ設計および分析用コンピュータソフトウェアプログラム</td><td>該当なし</td><td>コンピュータはSeahorse XF Pro Analyzer機器に接続されています。ダウンロード可能&nbsp;https://www.agilent.com/en/product/cell-analysis/real-time-cell-metabolic-analysis/xf-software/software-download-for-seahorse-wave-pro-software?productURL=https%3A%2F%2Fwww.agilent.com%2Fen%2Fproduct%2Fcell-analysis%2Freal-time-cell-metabolic-analysis%2Fxf-software%2Fseahorse-wave-pro-software-2007523。</td></tr><tr><td>タツノオトシゴ XF ベースメディウム:細胞外フラックスベースメディウム、pH 7.4</td><td>アジレント・テクノロジーズ</td><td>103334-100</td><td>ミトコンドリア関連試薬のストックおよび作業濃度の調製、および実験実行前のMH-S細胞の培養に使用されます。</td></tr><tr><td>タツノオトシゴXFグルタミン酸化ストレステストキット</td><td>アジレント・テクノロジーズ社</td><td>103674-100</td><td>ストック BPTES、オリゴマイシン、FCCP、およびロテノン/アンチマイシン A が含まれています。</td></tr><tr><td>Seahorse XF Pro Analyzer:細胞外フラックスバイオアナライザー</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>N/A</td><td>細胞外フラックスバイオアナライザー。</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak:96ウェル細胞外フラックスパックカートリッジ、96ウェル細胞外フラックスマイクロカルチャープレート、およびキャリブレーションソリューション</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>102416-100</td><td>細胞外フラックスバイオアナライザーを使用したアッセイ用のMH-S細胞の調製に使用されます。</td></tr><tr><td>血清ピペット&nbsp;</td><td>サンタクルスバイオテクノロジー株式会社</td><td>sc-550678</td><td>MH-S細胞から培地を除去するために使用されます。</td></tr><tr><td>重曹</td><td>Sigma Aldrich Co.</td><td>S6014</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr><tr><td>ピルビン酸ナトリウム&nbsp;</td><td>シグマ・アルドリッチ(株)</td><td>P4562</td><td>細胞外フラックスベース培地に使用。</td></tr><tr><td>T-75フラスコサンタ</td><td>クルスバイオテクノロジー社</td><td>sc-200263</td><td>MH-S細胞の培養に使用。</td></tr></tbody></table>

細胞外フラックスバイオアナライザーを用いた慢性エタノール曝露による肺胞マクロファージの燃料源としてのグルタミンの評価

Assessment of Glutamine as a Fuel Source for Alveolar Macrophages Exposed to Chronic Ethanol Using an Extracellular Flux Bioanalyzer

慢性的なEtOH曝露は、MH-S細胞のグルタミン依存性を低下させます。 グルタミン分解はミトコンドリア呼吸の重要な経路であり、グルタミンを細胞の生体エネルギー学の重要な燃料源として支えています。EtOHへの慢性的な曝露が、ミトコンドリア呼吸の燃料源としてのグルタミンに対するMH-S細胞の依存性を変化させるかどうかを判断するために、MH-S細胞をEtOH制御(Con)またはEtOHなしで処理し、ミトコンドリア呼吸に関連する試薬の連続注射に応答してOCRを経時的に測定した。オリゴマイシン(ATP合成酵素阻害剤)、FCCP(プロトンアンカプラー)、およびR / A(それぞれミトコンドリア複合体Iおよび複合体III阻害剤)の連続注射に応答するOCR生体エネルギープロファイルを使用して、ATP関連呼吸、最大呼吸、予備呼吸能力など、ミトコンドリア生体エネルギーの他のパラメーターを計算します。示されているすべてのデータは、Crotty et al.11に掲載されたCon +培地、Con + BPTES、およびEtOH+培地、EtOH+BPTES MH-S細胞実験グループの追加の生物学的複製です。図2Aに示すように、オリゴマイシンは複合体Vの阻害によりOCRを減少させ、FCCPは膜電位とミトコンドリア依存性ATP第12世代とのミトコンドリアの共役解除によりOCRを増加させ、R/Aはミトコンドリア依存性OCRを効果的にシャットダウンしました。これらのOCR生体エネルギー反応のプロファイルは、細胞外フラックスバイオアナライザー13,14を使用してミトコンドリアストレスを評価するためのユーザーガイドと一致しています。
ConおよびEtOH処理されたMH-S細胞で基礎OCRを測定した後、グルタミナーゼ1の阻害剤である培地コントロールまたはBPTESの注射をロードしました。Con + mediaとCon + BPTES MH-S細胞、およびEtOH +mediaとEtOH + BPTES MH-S細胞では、OCR生体エネルギープロファイルに差は示されませんでした(図2A)。EtOH + BPTES MH-S細胞は、Con + BPTESと比較してグルタミン依存性基礎呼吸の減少を示しました( 図2A および 図2Bの測定値#3と比較した測定値#4)。EtOH + BPTES MH-S細胞は、Con + BPTESと比較して、グルタミン依存性-ATP結合ミトコンドリア呼吸の喪失を示しました(図2C)。EtOH + BPTES MH-S細胞は、Con + BPTESと比較してグルタミン依存性最大呼吸の鈍的損失を示しましたが(図2D)、EtOH + BPTES MH-S細胞は、Con + BPTESと比較してグルタミン依存性予備呼吸能力の減少を示しました(図2E)。これらの結果は、EtOH MH-S細胞がFCCPでストレスを受けた場合と同様に、呼吸のためにグルタミンにより依存する能力を持っているが、グルタミン需要の増加がグルタミンバイオアベイラビリティの低下を上回っているため、それができない可能性があることを示唆しています。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig01.jpg"> 
図1:マウス肺胞マクロファージ細胞株であるMH-S細胞におけるグルタミン依存性ミトコンドリア呼吸と生体エネルギー測定のワークフローの一般的な概要。 細胞外フラックスマイクロカルチャープレートウェルで培養したMH-S細胞の単層(ステップ3.1)を、サプリメントを添加した細胞外フラックスベース培地(ステップ3.2)とともに、非CO2 加湿インキュベーターで37°Cで30分間〜1時間インキュベートしました(ステップ3.4)。サプリメントを添加した細胞外フラックスベース培地(ステップ3.2)を培地コントロールとして使用し、グルタミン酸化阻害剤BPTESの使用濃度を最終濃度3 μMに、ミトコンドリア複合体V阻害剤オリゴマイシン(オリゴ)を最終濃度0.5 μMに、ミトコンドリアアンカプラーカルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン(FCCP)を最終濃度0.5 μMに希釈し、ミトコンドリア複合体Iおよび複合体III阻害剤ロテノン/アンチマイシンA(R / A)を0.5 μMに希釈しました上部細胞外フラックスパックカートリッジにポートA-Dをローディングするための最終濃度(ステップ3.7)。細胞外フラックスバイオアナライザーを使用した実験実行の混合、待機、および測定時間の注入戦略は、ポートA(培地制御またはBPTES)の3分間の混合時間、0分の待ち時間、および3分間の測定時間の6回の測定でした。ポートB(オリゴ)の3分間の混合時間、0分の待ち時間、および3分間の測定時間の3つの測定。ポートC(FCCP)の3分の混合時間、6分の待ち時間、および3分の測定時間の3回の測定。ポートD(R / A)の3分間の混合時間、0分の待ち時間、および3分間の測定時間の3つの測定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67579/67579fig02.jpg"> 
図2:慢性エタノール(EtOH)は、マウス肺胞マクロファージ細胞株であるMH-S細胞のグルタミン依存性ミトコンドリア呼吸を減少させます。 MH-S細胞を未処理(Con)またはEtOHで処理(0.08%、72時間)し、経時的な酸素消費率(OCR)を細胞外フラックスバイオアナライザーを使用して測定しました 培地コントロールまたはグルタミン(GLN)酸化阻害剤(3μMのBPTES)を注射した後、ミトコンドリア複合体V阻害剤(0.5μMのオリゴマイシン、 オリゴ)、ミトコンドリアアンカプラー(0.5 μMのカルボニルシアン化物-p-トリフルオロメトキシフェニルヒドラゾン、FCCP)、およびミトコンドリア複合体Iおよび複合体III阻害剤(0.5 μMのロテノン/0.5 μMのアンチマイシンA、R / A)。(A)OCR生体エネルギープロファイルを使用して、グルタミン依存性、(B)基礎呼吸、(C)ATP関連呼吸、(D)最大呼吸、および(E)予備呼吸能力を計算しました。線形点は SEM ±平均を表します (n = 4、 #p &lt; 0.05 対 Con + media、*p &lt; 0.05 対 Con + BPTES、テューキーのポストホックによる一元配置 ANOVA)。バーは平均±SEMを表します(n = 4、*p &lt; 0.05対Con + BPTES、スチューデントの t検定)。提示されているデータは、未処理の対照および慢性のEtOH曝露MH-S細胞の培地対照およびBPTES処理実験群の追加の生物学的複製であり、これらはCrottyら11に掲載されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67579/67579fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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