Name: トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語) (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-10T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 12 s
Description: 学ぼう、自動スライド染色機を用いたハイスループット多重免疫蛍光アッセイの標準化プロトコル。大腸がん組織における免疫表現型の同定と空間プロテオミクス解析の再現性向上に役立つ革新的な翻訳医学研究手法です。

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高度にマルチプレックス化された免疫蛍光法(mIF)は、単一の組織切片1,2内の複数のタンパク質バイオマーカーを同時に可視化することを可能にすることにより、組織分析の分野に革命をもたらしている高度な技術です。この機能は、比類のないレベルの詳細と空間分解能を提供し、これは多くの場合、複数の空間スケールにわたる組織微小環境内の複雑な形態を持つ細胞タイプ間の相互作用を理解するために重要です3。この技術は、腫瘍バイオマーカー、タンパク質薬物標的、局所免疫およびチェックポイント状態、異なる細胞タイプ間の相互作用、さらには組織内の薬物代謝に関連する細胞内共局在パターンを共局在化するために使用できる腫瘍学研究において特に価値があります4,5,6。
その可能性にもかかわらず、ほとんどのmIFテクノロジーは、特に多重化機能と感度とスループットのバランスをとる際に、依然として大きな課題に直面しています。この制限は、HER2 や PD-L1 7,8,9 など、非常に低い発現を示す可能性のある臨床バイオマーカーの検出にとって特に重要です。その理由を理解するには、mIFの他のモダリティを理解することが不可欠です。これらの従来の方法は、より洗練されたmIFプラットフォームへの道を開きましたが、それらには独自の利点と制限があります。
直接免疫蛍光法(DIF)は、蛍光色素に直接結合した抗体、または蛍光色素を動員できるオリゴヌクレオチド10を使用します。この方法はマルチプレックス化が容易ですが、感度が低く、組織の背景や染色アーチファクトからのシグナルの分解が困難です。
間接免疫蛍光法(IIF)は、一次抗体に結合する二次抗体を使用します。これにより、プライマリベースのDIFと比較して信号が増加しています。改良されたフローセル設計と組み合わせることで、シーケンシャルIIFは1回のアッセイで最大40のバイオマーカーを検出できます2,11。しかし、これらは依然として、免疫組織化学(IHC)技術に見られるような酵素ベースのシグナル増幅戦略と比較して、感度が相対的に不足しています。
酵素触媒に基づく免疫蛍光法は、発色性(DAB)または蛍光色素沈着(チラミドシグナル増幅(TSA)など)に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)を使用するIHC法で最も頻繁に見られます。これらのアッセイは同じ触媒酵素に基づいているため、検出感度は類似しており、マルチスペクトルTSAベースのmIFアッセイは臨床アプリケーションに適しています2,12。DNAベースのシグナル増幅の利点は、優れたシグナル増幅とモジュール性を維持しながら、高度なマルチプレックス化が可能なことです。対照的に、HRP ベースの分析法はモジュール化が難しく、最適化が難しいため、追加のパネル開発および試験サイクルが必要になります。
DNAバーコード付き抗体免疫蛍光 ここで示すmIFアッセイでは、DNAポリメラーゼを使用してDNAバーコード付き抗体を同時に増幅し、その後、イメージングラウンドごとに4つの蛍光オリゴヌクレオチドを使用したレポータープローブの染色と脱染色のサイクルを行います(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig01.jpg"> 
図1:マルチプレックス免疫蛍光アッセイプロトコルの図解。 バーコード標識抗体を1ステップで添加し、同時にバーコードを増幅します。各サイクルに4つの蛍光プローブのグループが追加されるため、4つのマーカーを一度に視覚化できます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
このシングルラウンド抗体の添加とシングルステップ増幅により、アッセイプロトコルが大幅に簡素化されます。このプロセスは、自動化されたハイスループット染色およびスキャンシステムによって促進され、臨床試験で利用される多数のサンプルでスライド間およびバッチ間で再現性のある結果が得られます13。
この技術の主な利点の1つは、高感度を維持しながら広範な多重化を可能にする能力です2。また、このワークフローにより、イメージングスループットを高く保つことができるため、臨床試験における高度にマルチプレックス化されたmIFテクノロジー(&gt; 8バイオマーカーなど)の主要な制限の1つに対処します。これは臨床研究では特に重要であり、患者間での低存在量の薬物標的(低HER2など)の微妙な変動が治療反応に関する重要な洞察を提供する可能性があります。
これらの主要な特性に加えて、このアッセイは、パネル設定可能性、ハイスループットのホールスライドイメージング機能、および細胞内プロセスとコンパートメント、およびマクロファージと樹状細胞に関連する細胞突起の研究に必要な光学分解能も提供します。複雑な細胞表現型を複数の空間スケールで調査できることは、イメージングマスサイトメトリー(IMC)ベースの方法と比較した場合の光学イメージングの重要な利点です2。
この研究では、8プレックスmIFアッセイのプロトコルを、オートステイナーとホールスライドスキャナーを使用して提示します。このアッセイには、CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1、および汎サイトケラチン14の8つの一次抗体のパネルが含まれています。このマーカーパネルにより、腫瘍組織の免疫プロファイリングと、腫瘍または間質環境で見つかった細胞の同定が可能になります。このプロトコールでは、初期染色とプローブ交換ラウンドに自動スライドステイナーを使用し、染色とイメージングは2日以内に完了できます。mIFアッセイの検証方法と、得られた画像の解析方法も示されています。

<table><tbody><tr><td>抗CD3</td><td>Ultivue</td><td></td>ク<td>ローンBC33(BioCare)。ULT50801</td></tr><tr><td>抗CD4</td><td>Ultivue</td><td></td>ク<td>ローンSP35(Abcam)の一部。ULT50801</td></tr><tr><td>抗 CD68</td><td>Ultivue</td><td></td><td>クローン KP1 (BioCare) の一部。ULT50801</td></tr><tr><td>抗 CD8</td><td>Ultivue</td><td></td><td>クローン C8/144B (BioCare) の一部。ULT50801</td></tr><tr><td>抗サイトケラチン + 抗 SOX10</td><td>Ultivue</td><td></td><td>クローン AE1/AE3 (Bethyl Labs) および BC34 (BioCare) の一部。ULT50801の一部、混合物として提供される抗</td></tr><tr><td>FOXP3</td><td>Ultivue</td><td></td><td>Clone 236A/E7(Thermo)。ULT50801</td></tr><tr><td>抗PD1</td><td>Ultivue</td><td></td>ク<td>ローンCAL20(Abcam)の一部。ULT50801</td></tr><tr><td>抗PDL1</td><td>Ultivue</td><td></td>ク<td>ローン73-10(Abcam)の一部。ULT50801</td></tr><tr><td>Axioscan.Z1 顕微鏡</td>の一部 <td>ツァイ</td><td></td>ス 蛍<td>光顕微鏡と呼ばれ、本文で</td></tr>ボン<tr><td>ド脱ワックス溶液</td><td>ライカ</td><td>AR9222</td><td></td></tr><tr><td>ボンド エピトープ回収溶液 2</td><td>ライカ</td><td>AR9640</td><td></td></tr><tr><td>ボンド オープン コンテナ、30 mL</td><td>ライカ</td><td>OP309700</td><td></td></tr><tr><td>ボンド研究検出キット</td><td>ライカ</td><td>DS9455</td><td></td></tr><tr><td>ボンド滴定インサート</td><td>ライカ</td><td>OPT9049</td><td></td></tr><tr><td>ボンド滴定キット</td><td>ライカ</td><td>OPT9719</td><td></td></tr><tr><td>ボンド ユニバーサル カバータイル</td><td>ライカ</td><td>S21.4611</td><td></td></tr><tr><td>ボンドウォッシュ ソリューション 10x 濃縮液</td><td>ライカ</td><td>AR9590</td><td></td></tr><tr><td>BondRX オートステイナー</td><td>ライカ</td><td></td>は<td>テキストで「オートステイナー」と呼ばれています</td></tr><tr><td>BondRX ソフトウェア</td><td>ライカ</td><td></td><td>バージョン6.0以降</td></tr><tr><td>カバースリップ、#1.5厚さ</td><td>Corning</td><td>2980-244</td><td></td></tr><tr><td>エタノール、200プルーフ</td><td>VWR</td><td>89370-084</td><td></td></tr><tr><td>FFPE組織ブロック</td><td>BioIVT</td><td></td><td>組織の種類はさまざま</td></tr><tr><td>OmniVUE 8-plexアッセイ(CD3、CD4、CD8、CD68、FOXP3、PD-1、PD-L1、汎サイトケラチン/SOX10)</td><td>Ultivue</td><td>ULT50801</td>には<td>、他のすべてのUltivue成分が含まれています</td></tr>リン<tr><td>酸緩衝生理食塩水(PBS)</td><td>Boston BioProducts</td><td>C-9911F</td><td>(pH 7.4、2.7 mM KClおよび137 mM NaCl)</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo</td><td>P10144は</td><td>、本文</td></tr><tr><td>UltiAnalyzer.AI Ultivue</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UltiStacker.AI</td><td>Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue Ultivue Amplification Buffer</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue抗体の一部 希釈剤</td><td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultivue 交換バッファー</td>の一部 <td>Ultivue</td><td></td> ULT50801 <td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Exchange Initiator</td> の一部 <td>Ultiv</td><td>ULT50801</td>ue <td></td></tr><tr><td>Ultivue Neutralizer</td> の一部 <td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue 蛍光プローブの一部 1</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue蛍光プローブの一部 2</td><td>Ultivue</td><td></td><td>ULT50801</td></tr><tr><td>Ultivue Pre-Amplification Mix</td>の一部 <td>Ultivue Ultivue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe</td>の一部 <td>Buffer Ultivue</td><td></td> ULT50801 <td>ULT50801</td></tr>超<tr><td>純水</td>の一部 <td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr></tbody></table>

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

High-Throughput Automated Multiplex Immunofluorescence Assays for Translational Research

上記のプロトコルに従って、FFPE組織を複数のターゲットで染色し、4つのグループ内のすべてのマーカーの高品質画像が取得されています(図3A、B)。画像共登録ソフトウェアを使用すると、 図3Cに示すように、同じスライドの画像を結合して共登録できます。同様の結果を、結腸直腸癌(CRC)組織スライドの 図4 に示します。
プロトコルの成功は、予想される染色パターンを評価することによって判断する必要があります。示されているCRCの例では、染色された各ターゲットは、予想される細胞内コンパートメント、例えば、核FoxP3、膜状CD3、細胞質CD68で発現している(図4B-D)。PD1とCD3の共局在の例、またはPDL-1とCD68の例で示されるように、各機能的標的は適切な細胞型で発現しており、それぞれ消耗したT細胞と免疫抑制マクロファージを示しています。良好なシグナル対バックグラウンド比の評価は、真の陽性シグナルと潜在的なバックグラウンドノイズをうまく区別できるように、通常、病理学者または画像分析の専門家によって定性的に行われ、染色の品質を確認し、画像分析を成功させることができます。染色の品質と性能をさらに確認するために、シリアル切片のゴールドスタンダードIHC(発色性DAB)との比較(図5の例を参照)や、ほとんどの免疫標的にとって染色の成功を確認するのに役立つヒト扁桃腺などのポジティブコントロール組織サンプルを追加することができます。がんはヒト扁桃腺16よりも標的の発現が低い場合があることに注意してください。
定性的に結果を確認した後、定量分析を行うことができます。この研究では、これは主に、特定のターゲットを発現するさまざまな表現型(細胞数/ mm2)の細胞密度を計算することと、幅広いダイナミックレンジの発現を示すことができる機能ターゲットの平均強度レベルを計算することで構成されます。mIFアッセイの精度を評価する場合、同じマーカーで染色したシリアル切片は、スライド間で同等のシグナルを示すはずであり、 これは図6で定性的に示すことができます。さまざまな組織タイプにおける単一マーカー密度の定量結果の例を 図7に示します。これらの画像に対する画像解析により、陽性細胞を同定し、各マーカーに対応する陽性細胞密度、および陽性細胞あたりの平均シグナル強度を計算できます。これにより、各マーカーの変動係数(CV)を計算して、マルチプレックスアッセイの精度を評価できます(表4)。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig03.jpg"> 
図3:8プレックス免疫蛍光プロトコルでの連続染色ラウンドから得られた組織マイクロアレイ(TMA)コアの画像。 (A)マーカーCD8、PD1、PD-L1、およびCD68を特徴とする最初のイメージングから得られた画像。交換プロトコル後、(B)はマーカーCD3、CD4、FoxP3、およびCK/SOX10の2ラウンド目を同じスライド上に示し、(C)は(A)と(B)の画像を組み合わせた共登録画像を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig04.jpg"> 
図4:8プレックス免疫蛍光染色による結腸直腸癌(CRC)組織の代表的な染色。 この図は、同じ細胞内の複数のターゲットを共局在させることで同定できる細胞表現型を示しています。(トップ)大腸がん組織の全スライド画像。(下)(A)T-reg細胞(CD3+/CD4+/FOXP3+)、(B)腫瘍および間質内のPD-1-およびPD-L1-発現細胞、(C)疲弊した細胞傷害性T細胞(CD3+/CD8+/PD-1)、(D)免疫回避腫瘍細胞(PD-L1+/CK+)および免疫抑制性マクロファージ(CD68+/PDL1+)を強調表示する組織領域の詳細な図。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig05.jpg"> 
図5:免疫組織化学染色(IHC)染色と免疫蛍光染色(IF)染色の定性的比較。 シングルマーカー免疫組織化学染色(DAB、上段)、シングルマーカー免疫蛍光染色(ISPモノプレックス)、およびマルチプレックス免疫蛍光のシングルチャンネルビュー(ISPマルチプレックス)で染色したシリアル切片は、異なる染色方法間の定性的な一致を示しています。スケールバー = 100 μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig06.jpg"> 
図6:シリアル切片染色(A)マルチティッシュTMAのレイアウトを示す図。(B)TMAにおける各組織タイプの組織コアの代表的な8プレックス画像。(C)1回のランで染色された6つの連続TMA切片にわたる扁桃腺コアのCD8の代表的な画像。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig07.jpg"> 
図7:TMAに含まれる組織タイプごとの単一マーカー密度定量。 組織あたりの密度は、TMA スライド上の各組織タイプの 3 つの代表的なコアの平均密度です。y軸は、x軸上のさまざまな組織タイプの単一マーカー密度を、陽性細胞/mm2の単位で表します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67584/67584fig08.jpg"> 
図8:このプロトコルに記載されている増幅されたISP mIFと間接IFを比較した相対蛍光シグナルの関心領域(ROI)解析。 (A)CK(左)またはPD-L1(右)用に染色された代表的なスライドで、5つのROIが示されています。(B)CK(上)とPD-L1(下)の代表的なROI画像。増幅されたmIF(紫)と間接IF(青)で、(C)CKと(D)PD-L1の5つのROIで達成された平均シグナル強度(それぞれ100μm x 100μm、約200個の細胞を含む)。Y軸の値は任意の蛍光単位を示し、エラーバーは標準偏差(n = 3)を示します。(E)増幅されたISP mIF(紫)と間接IF(青)で達成される相対信号強度は、すべてのROIで平均増幅されたmIF信号と平均間接IF信号の比を取ることによって計算されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/67584fig08large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
表4:計算された分散係数(CV)。 扁桃腺画像の正の細胞密度と平均信号強度のCVを 図6に示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67584/Table04_RE.xlsx" target="_blank">この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Multiplex immunofluorescence (mIF) is an advanced technique that allows for detailed, spatially resolved analysis of tissue samples by visualizing ...

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がん研究

ここでは、サンプルの限られた量を扱う場合は特に、マイクロRNA（miRNA）の発現レベルのコストと時間効果のハイスループットスクリーニングのツールと​​してのマイクロ流体プラットフォームとの組み合わせで最適化された多重逆転写定量PCR（定量RT -...

ハイスループットマイクロRNAプロファイリング：最適化されたマルチプレックスフリューダイナミックArrayTMのIFCSでナノリッタースケールでの定量RT - PCR

ルミネックス社のXMAPのミクロスフィア技術を使用して、我々は様々な実験動物種のserosurveillanceの多重蛍光イムノアッセイ（MFIA）を開発しました。 MFIAは、抗原、組織制御や免疫グロブリンが共有結合し、色分けされたポリスチレン微小球にリンクされているサスペンションマイクロアレイである。...

多重化された蛍光イムノアッセイテスト方法とトラブルシューティング

私たちは、現在の研究では、トランスジェニックマウス由来のリンパ球を用いた新規蛍光ベースのアッセイを提示します。このアッセイは、阻害またはリンパ球活性化を促進するいずれかの能力を付与する小分子のハイスループットスクリーニング（HTS）に適しています。...

小分子のハイスループットスクリーニングのための適切な蛍光ベースのリンパ球アッセイ

ホルマリン固定癌組織標本の腫瘍免疫研究の自動多重蛍光パネル

ここで多重蛍光免疫組織染色とリンパ腫における複数のがん関連抗原の同時定位のためのイメージング プロトコルについて述べる。このプロトコルは、すべての組織切片内バイオ...

多重蛍光免疫組織化学染色、イメージング、およびリンパ腫の組織学的試料中の分析

多重蛍光免疫組織化学は、無傷のホルマリン固定、パラフィン埋め込み(FFPE)組織内の複数の細胞タイプの可視化を可能にする新しい技術です。抗体と試薬を最適化し、スライドを準備し、一般的な問題を回避するためのヒントを準備するための指示を持つ7色多重を成功させるためのガイドラインを提示します。...

手動多重蛍光免疫組織化学における最適化、設計、および落とし穴の回避

凍結組織に対してマルチスペクトルイメージングを行う迅速な染色法について述べます。...

凍結組織切片の多スペクトル蛍光イメージングの迅速な方法

マルチウェルマイクロプレートを用いた自動アッセイは、単一の実験で多数の条件の評価を可能にすることによって経路調節因子を同定するための有利なアプローチである。ここでは、十分に確立されたマクロピノソームイメージングおよび定量プロトコルを96ウェルマイクロプレート形式に適合させ、マルチモードプレートリーダーを使用した自動化の包括的な概要を提供します。...

蛍光標識マクロピノソームの定量のための自動イメージングおよび分析

本稿では、チラミドシグナル増幅(TSA)マルチプレックス免疫蛍光法(mIF)と画像解析および空間解析を組み合わせたプロトコルについて説明します。このプロトコルは、実験室で利用可能なスライドスキャナーに応じて、スライドごとに2〜6個の抗原を染色するために、ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)セクションで使用できます。...

腫瘍微小環境の臨床的および生物学的評価のための空間画像解析と組み合わせたマルチプレックス免疫蛍光法

手動IBEX法による低コストで汎用性の高い光照射技術の実装により、有意な天然自家蛍光でヒト組織の最適なイメージングが可能になります。このプロトコルでは、倒立顕微鏡、広く利用可能な試薬、および画像のアライメントと処理のためのオープンソースソフトウェアを使用して、アーカイブされた臨床サンプルからマルチプレックス化されたホールスライド画像を取得する方法を詳しく説明しています。...

反復漂白に最適化されたワークフローにより、高自家蛍光の臨床サンプルのマルチプレキシティイメージングが拡張されます

多重免疫蛍光は、単一の組織切片内で複数の抗体マーカーを逐次標識し、組織構造や細胞集団の空間解析を支援します。ここでは、老化に関連する構造的および免疫マーカーの多重検出のためのワークフローを紹介し、手動および自動スライド準備、反復画像診断、デジタル病理ソフトウェアを用いた単細胞解析を含みます。...

生体内での老化マーカーの空間評価のための多重免疫蛍光アッセイ

学ぼう、自動スライド染色機を用いたハイスループット多重免疫蛍光アッセイの標準化プロトコル。大腸がん組織における免疫表現型の同定と空間プロテオミクス解析の再現性向上に役立つ革新的な翻訳医学研究手法です。

トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

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