トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

私たちは、迅速かつ高感度のマルチプレックス免疫蛍光アッセイ用のキットを開発しています。ここでの目標は、研究者がFFPE組織に現れるさまざまな細胞型をプロファイリングできるようにすることです

免疫蛍光は、通常、色素標識またはペルオキシダーゼ標識二次抗体を使用して行われます。免疫組織化学は低プレックスになる傾向があります。色素標識二次抗体はシグナルが低い。チラミドシグナル増幅アッセイは最適化に手間がかかり、実行には数時間から数日かかります。

アッセイのマーカーは事前に最適化されており、他の技術よりも大幅に高速です。4つのマーカーを立たせると8時間もかからず、4つのバイオマーカーが追加されるごとに約3時間かかります。

マルチプレックス免疫蛍光をより速く実行できるため、空間プロテオミクスをより広く適用できるようになり、組織の空間的構造を理解するための障壁が軽減されます。

[ナレーター]まず、すべてのキット試薬を室温で解凍します。抗体複合体、増幅酵素、交換開始剤、および交換中和剤は、使用するまで摂氏マイナス20度で保管してください。解凍した抗体希釈剤をボルテックスします。抗体希釈液を容器にピペットで入れます。短時間遠心分離し、すべての抗体を抗体染色液1容器に加えます。提供された抗体希釈液を1〜100希釈で添加します。次に、ピペットを使用して、渦を避けて溶液を穏やかに混合します。解凍後、プレ増幅混合溶液をボルテックスして完全に混合します。次に、溶液をそれぞれの混合容器に加えます。増幅バッファーをボルテックスし、ピペットで増幅酵素を混合します。増幅酵素を増幅バッファーで1〜10の比率で希釈して、増幅バッファーを作成します。渦を避けてピペッティングで穏やかに混合します。次に、提供された核対比染色溶液をボルテックスして遠心分離し、超純水で1〜100に希釈します。次に、蛍光プローブ1溶液をプローブバッファーで1〜20の比率で希釈します。試薬の量を測定できるように、完全な試薬ワンドを装置に挿入します。すべての試薬が準備されたら、自動染色ソフトウェアの上部にある「スライド設定」タブに移動します。「スタディの追加」ボタンをクリックし、必要に応じてスタディID、スタディ名、およびスタディコメントを入力します。[ディスペンスボリューム]で、150マイクロリットルを選択し、準備方法として*デワックス4ステップを選択します。ドロップダウンで使用できない場合は、[プロトコル設定] メニューを開き、優先チェックボックスをオンにして、[OK] をクリックします。スタディが作成されたら、スライド設定画面の右側にあるスライドの追加ボタンをクリックします。[スライドのコメント] にスライドの一意の名前を入力します。適切なフィールドで [組織タイプ] を [組織をテスト] に設定します。次に、ディスペンスボリュームに150マイクロリットルを選択し、左側のドロップダウンで染色モードをシングルに設定し、右側のドロップダウンでルーチンに設定します。[プロセス]で[IHC]を選択し、[マーカー]を抗体染色溶液に設定します。[スライドの追加]ウィンドウの[プロトコル]セクションで、[染色]に[染色アッセイ1]、[調製に*デワックス4ステップ]、[HIERの場合はER2で*HIER 20分]を選択します。酵素プロトコルをアスタリスクダッシュに設定したままにし、すべてのフィールドが入力されたら[スライドの追加]をクリックします。すべてのスライドを追加したら、[スライドの追加]ウィンドウを閉じてスライドラベルを印刷し、それぞれを対応する組織セクションに貼り付けます。ラベルの付いた各スライドをトレイにセットし、各組織セクションの上にカバータイルを置きます。スライドトレイを装置に挿入し、ソフトウェア画面の右側から対応する自動染色機を選択します。3つのスライドトレイすべてと、バルク試薬と調製試薬を含むすべての試薬情報が表示されていることを確認します。バルク試薬容器が十分に満たされていること、および廃棄物容器に実行を完了するのに十分な容量があることを確認します。次に、再生ボタンを押して染色実行を開始し、手順が完了したら自動染色機からスライドをタイムリーに取り除くようにします。染色したスライドをPBSバッファーに入れ、封入剤を使用してカバースリップを貼布します。蛍光顕微鏡またはアッセイ色素と互換性のあるフィルターを備えたスライド全体スキャナーを使用してスライドを画像化します。交換アッセイでは、交換バッファーを室温で解凍します。交換中和剤と交換開始剤は、使用準備が整うまで摂氏マイナス20度に保管してください。2つの試薬滴定容器を準備し、交換プロトコル中に使用する検出キットを取り出します。交換バッファをボルテックスします。そして、交換開始剤をピペットで混合します。交換溶液を指定された容器に入れ、必要な量の交換開始剤と交換バッファーを混合して調製します。ピペッティングのみで内容物を混合します。次に、蛍光プローブ2溶液をそれぞれの容器内の希釈交換バッファーと混ぜ合わせます。プローブバッファーと蛍光プローブの混合物のみをボルテックスし、ピペットは最終溶液を混合します。 準備されたすべての試薬を含む完全な試薬ワンドを自動染色機に置きます。すべての試薬でディップテストを実行できるようにします。スライドを追加したら、マーカーを *ネガティブに設定します。また、調製、HIER、および酵素では、交換プロトコルに脱ろうや抗原回収が不要なため、アスタリスクダッシュオプションを選択します。完了したら、[スライドを追加] をクリックします。すべてのスライドを追加したら、スライドの追加ウィンドウを閉じ、対応する各組織切片に貼り付けるスライドラベルを印刷します。各スライドをトレイにセットし、各組織セクションにカバータイルを置き、トレイを自動染色機に入れます。次に、再生ボタンを押して実行を開始します。8プレックス免疫蛍光プロトコルを使用して2回の染色ラウンドでキャプチャされた組織マイクロアレイコアの画像は、各ラウンドで異なる免疫マーカーを示し、両方のラウンドを統一されたコンポジットに組み合わせた画像の共同登録に成功しました。結腸直腸癌組織の全スライドイメージングにより、制御性T細胞、枯渇したT細胞、免疫抑制性マクロファージなどのマーカーの共局在化に基づいて免疫表現型を同定することができました。免疫蛍光染色により、制御性T細胞におけるCD3、CD4、およびFoxP3の共発現が示されました。腫瘍および間質細胞におけるPD1およびPDL1。枯渇した細胞傷害性T細胞におけるCD3,CD8およびPD1免疫抑制マクロファージにおける CD 68 と PDL1。単一マーカーの免疫組織化学と単一または多重免疫蛍光の比較により、すべてのマーカーにわたる染色パターンの定性的一致が確認されました。異なる組織タイプにわたる連続切片染色により、代表的な組織コアを持つ免疫マーカーの一貫した発現パターンが確認され、染色の成功と最小限の変動が示されました。CD8の6つの連続スライドで染色された扁桃腺切片は、すべての画像でほぼ同じシグナル分布で高い再現性を示しました。組織タイプ全体にわたるマーカー陽性細胞密度の定量化では、扁桃腺とリンパ節で密度が最も高く、黒色腫と結腸で最も低いことが示されました。