Name: 蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: 学ぶショウジョウバエの脚の発達における長期ライブイメージング法。蛹殻を除去し上皮細胞の動的形態変化とパルテノン様構造を観察する。この安定した手法は初心者にも適しており、形態形成のメカニズム解明に貢献する。

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<meta charset="utf8"></head><body>蛹を伴わない ショウジョウバエ の蛹脚形態形成の拡張ライブイメージング

<ol><li>Koto, A., Kuranaga, E., Miura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+regulation+of+Drosophila+IAP1+determines+caspase+functions+in+sensory+organ+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Temporal regulation of Drosophila IAP1 determines caspase functions in sensory organ development.</a> J Cell Biol. 187 (2), 219-231 (2009).</li>
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<li>Mirth, C., Akam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Joint+development+in+the+Drosophila+leg%3A+Cell+movements+and+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Joint development in the Drosophila leg: Cell movements and cell populations.</a> Dev Biol. 246 (2), 391-406 (2002).</li>
<li>Mirth, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecdysteroid+control+of+metamorphosis+in+the+differentiating+adult+leg+structures+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Ecdysteroid control of metamorphosis in the differentiating adult leg structures of Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 278 (1), 163-174 (2005).</li>
<li>Tajiri, R., Misaki, K., Yonemura, S., Hayashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+shape+changes+of+ECM-producing+cells+drive+morphogenesis+of+ball-and-socket+joints+in+the+fly+leg%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic shape changes of ECM-producing cells drive morphogenesis of ball-and-socket joints in the fly leg.</a> Development. 137 (12), 2055-2063 (2010).</li>
<li>Hiraiwa, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unveiling+the+cell+dynamics+during+the+final+shape+formation+of+the+tarsus+in+Drosophila+adult+leg+by+live+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Unveiling the cell dynamics during the final shape formation of the tarsus in Drosophila adult leg by live imaging.</a> Dev Genes Evol. , (2024).</li>
<li>ImageJ plugin page. , Signaling RIKEN. Available at: 
 <a target="_blank" href="https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/">https://signaling.riken.jp/en/en-tools/imagej/629/</a> (2024).</li>
<li>Pandey, R., Heidmann, S., Lehner, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+re-organization+and+dynamics+of+progression+through+mitosis+in+Drosophila+separase+complex+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Epithelial re-organization and dynamics of progression through mitosis in Drosophila separase complex mutants.</a> J Cell Sci. 118 (4), 733-742 (2005).</li>
<li>Kiehart, D. P., Galbraith, C. G., Edwards, K. A., Rickoll, W. L., Montague, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+forces+contribute+to+cell+sheet+morphogenesis+for+dorsal+closure+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Multiple forces contribute to cell sheet morphogenesis for dorsal closure in Drosophila.</a> J Cell Biol. 149 (2), 471-490 (2000).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>35mm/ガラスベースディッシュ</td><td>岩城</td><td>3911-035</td><td></td></tr><tr><td>クリーニングワイプ</td><td>日本製紙クレシア</td><td>S-200</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #3c 鉗子</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11231-20</td><td></td></tr><tr><td>デュモン #5SF</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>エッペンドルフリサーチプラス 2-20 & マイクロ;L</td><td>Eppendorf</td><td>3123000098</td><td></td></tr><tr><td>Fly strain: His2Av-mRFP, sGMCA</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>59023</td><td></td></tr><tr><td>FV3000</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>倒立共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>FV31S-SW</td><td>EVIDENT</td><td>FV3000</td><td></td></tr><tr><td>G40L</td><td>用ソフトウェア Shin-Etsu シリコーン</td><td></td><td>シリコーン グリース</td></tr><tr><td>マイクロ カバー ガラス 18 x 18 mm 0.13-0.17 mm</td><td>松波</td><td>C018181</td><td></td></tr><tr><td>マイクロスライドガラス 76×26 mm 0.9-1.2 mm</td><td>松波</td><td>S7213</td><td></td></tr><tr><td>NEO-SABLE サイズ0 丸型</td> 細<td>ペンテル</td><td>XZBNR-0</td><td>絵筆</td></tr><tr><td>SIL300CS-30CC</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>シリコーンオイル</td></tr><tr><td>実体顕微鏡システム SZX7</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>テルモシリンジ 50mL</td><td>テルモ</td><td>SS-50ESZ</td><td></td></tr><tr><td>透明両面テープ</td><td>スコッチ&nbsp;</td><td>665-1-12</td><td>内層は外層よりも接着力が強いため、蛹の固定には内層を使用する必要があります。</td></tr><tr><td>UPLSAPO10x</td><td>EVIDENT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPLSAPO40XS</td><td>EVIDENT</td><td></td><td>シリコン浸漬レンズ</td></tr><tr><td>Vannas スプリングはさみ - 2.5mm カッティングエッジ</td><td>ファイン サイエンス ツール</td><td>15000-08</td><td>オプション</td></tr></tbody></table>

蛹摘出後の ショウジョウバエ の蛹の脚の発達の長期ライブイメージング

Long-Term Live Imaging of Drosophila Pupal Leg Development After Puparium Removal

ここでは、蛹期の発育中のショウジョウバエ成虫の脚の44時間ライブイメージングの例について説明します。His2Av-mRFP17(標識核)およびsGMCA18(GFP標識アクチン結合タンパク質Moesin、標識アクチン)を発現するハエを白色蛹期に採取し、25°Cで15時間インキュベートした。 蛹は、プロトコルに従って取り外して取り付けました(図2)。脚の先端付近にある足根骨と足根前筋のZスタック画像は、室温(厳密ではありませんが、25°C付近)で16時間から60時間のAPFまで15分ごとに取得されました。一連の画像の前半を図3に、後半を図4に、全体の動画を動画1に示します。脚の組織が急速に狭くなると、上皮細胞は一過性に興味深い構造、つまりパルテノン神殿のような構造を形成し、その頂端基底突起と基底結合を特徴とする(図3)。上皮の厚さの減少は、アウトラインがほぼ完成した後でも観察されました(図4)。全体のプロセスを図 1 に示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig1.jpg"> 
図1:蛹期におけるショウジョウバエ成虫の足根骨の最終的な形状形成の概要。プロセス全体は、長期のライブイメージング実験で観察された組織レベルと細胞レベルの両方での形態学的変化に基づいて、5つの段階に分けられました。左側には、いくつかの時点に対応する代表的な写真または表面レンダリング画像(sGMCA信号)が示されています。右側には、各ステージのイベントの簡単な説明が書かれています。この図は、Hiraiwa et al.15から修正されています。ムービー1も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig2.jpg"> 
図2:ライブイメージングのための蛹の除去とマウントアセンブリ (A)皿に集められた白い蛹。(B)蛹は、25°Cで15時間インキュベートした後、(A)で示されました。 シアン色に着色された領域は、蓋を示します。(C)両面テープに蛹が接着されている写真。(民主党-日本)蛹の除去手順を示す一連の画像。(D)蓋は鉗子で持ち上げられます。(E)蓋が取り除かれます。(F)鉗子の先端を蛹のキューティクルと蛹の間に挿入します。(G)蛹が部分的に開いている。(H)鉗子の先端を再度挿入します。(I)蛹が開き、後端のごく一部だけが残りました。(J)絵筆で持ち上げられている蛹。(K)蛹の体液漏れの一例。鉗子の先端で突かれた傷口から出てくる液体は、矢印で示されます。(L-N)マウントの組み立てを示す画像とイラスト。(L)ガラス底皿の底に置かれた蛹と蒸留水を示す上側から見た画像。(M)マウント組立完了後のディッシュ。ガラス部分の縁に沿ってシリコングリースを貼り、その上にカバースリップを貼ってシールしました。(N)ショ ウジョウバエ の蛹の長期ライブイメージングのための取り付けアセンブリの概略図。(O)ほぼ成体に発達した騎乗した蛹。(P)マウントされた蛹のeclosing。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig3.jpg"> 
図3:16-27.5時間のAPFにおける足根上皮細胞の動的形状変化 (A)腹側から見た蛹のイラスト。破線の四角形は、(B-E) で観測された領域に対応します。L1:第1レグ、L2:セカンドレグ、L3:第3レグ(B,C,D,E) SGMCA(緑)およびHis2Av-mRFP(マゼンタ)を発現するハエの足根の遠位部のライブイメージングからの静止画。組織は急速に狭くなり、関節領域のくぼみが進行します。(B',C',D',E')(B,C,D,E)の破線で囲まれた領域の倍率。(C')の矢印と矢印は、それぞれ先端基底突起の例と基底結合の位置を示しています。パルテノン神殿のような構造は、(B')で形成され始め、(C')で完全に形成され、(D')で消え始め、(E')で見えにくくなります。遠位は右にあり、背側はすべての図で上部にあります。ステージは(B、C、D、E)の右下隅に示されています。スケールバー:B、C、D、E:50μm;B',C',D',E': 10 μm.この図は、Hiraiwa et al.15から修正されています。ムービー1も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig4.jpg"> 
図4:41-60時間のAPFにおける足根上皮細胞層の形状変化(A,B,C,D) 図3と同じライブイメージングのシーケンシャルデータセットからの静止画。(A,B,C,D) の破線の四角形は、それぞれ (A',B',C',D') に拡大されます。48時間APF(A-B')頃までに、剛毛、爪、およびpulvilliの伸長などの外形形成はほぼ完了します。陥入した関節の底部は近位に移動し、その後、約54時間のAPF後にボールとソケットの構造形成が進行しました。背側上皮と腹側上皮の形態学的な違いが明らかになりました(B'、C'、D'の二重矢印と開いた二重矢印)。54時間APF(C-D')後、上皮層はセグメントの輪郭をほとんど変えずにその厚さを減少させました。背側はすべての図で上部にあり、右遠位にあります。スケールバー:A、B、C、D:50μm;A',B',C',D': 20 μm.この図は、Hiraiwa et al.15 から引用されています。ムービー1も参照してください。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67597/67597fig5.jpg"> 
図5: Bright Z関数を使用した脚の観察例。 (A,B)sGMCA(緑)とHis2Av-mRFP(マゼンタ)を発現するフライの第3レグの対応する領域、深さ、およびステージの画像(B)または(A)をBright Z関数を使用して使用。(A)ブライトZ機能を使用せずに取得した16時間APFの第3レグの足根部の観察から抽出された深さ59.1μmのXY平面。(A')断面図は(A)の黄色の縦線に対応しています。(A')の縦線は(A)の焦点面を示します。(B)Bright Z関数を使用して取得した16時間APFの第3レグの足根部の観察から抽出された深さ61.6μmのXY平面。PMT電圧とレーザー出力の両方を調整しました。(A)に比べて画像の視認性が向上しています。(B')断面図は、(B)の黄色の垂直線に対応しています。(B')の黄色の縦線は(B)の焦点面を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:15-30時間のAPFからの脚の足根部のライブイメージングのための共焦点顕微鏡設定の例。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/67597_Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
動画1:足根骨の遠位部分の 44 時間の長期ライブイメージング。sGMCA(緑)とHis2Av-mRFP(マゼンタ)を発現させたフライを使用しました。最も代表的なXY平面は、図3および図4と同じデータセットから抽出されました。矢印は、将来の関節領域の例を示しています。組織内で急速に移動する細胞はマクロファージ様細胞です。足根骨セグメントに沿って伸びる弦状の信号は、中隔の一部です。タイムスタンプは hh: mm と表示されます。遠位は右に、背側は上部にあります。この映画は、Hiraiwa et al.15から改作されています この<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67597/Movie%201.mp4" target="_blank">ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

Over the past decades, significant progress has been made in understanding the mechanisms of cell fate determination. However, the process by which ...

long-term-live-imaging-drosophila-pupal-leg-development-after

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のためのメゾスコピック蛍光トモグラフィー生体内</em開発の>イメージングショウジョウバエ</em

このビデオでは、我々は非対称的に無傷で感覚器官の前駆細胞と表皮細胞を割っての生細胞イメージングのための方法を説明します。...

無傷の感覚器官の前駆細胞の生細胞イメージングショウジョウバエ蛹

ソース: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp.

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