Name: 遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 13 s
Description: 学ぼう、スライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション技術を用いた遺伝子機能解析法。神経前駆細胞における遺伝子発現制御メカニズムと神経発達障害の研究に応用できます。

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<meta charset="utf8"></head><body>エレクトロポレーションによるスライスされたヒト皮質オルガノイドにおけるCRISPR/Cas9遺伝子ノックアウト

<table><tbody><tr><td>15 mL PP遠心チューブ、円錐</td>形 <td>Corning</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector Core Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector X Unit</td><td>Lonza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mLポリスチレン丸底チューブ、セルストレーナーキャップ付き</td><td>Corning</td><td>Falcon 352235</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate、nunclon 処理</td><td>サーモフィッシャー</td><td>140675</td><td>hiPSC用培養</td></tr><tr><td>6 ウェルプレート、超低アタッチメント</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>オルガノイド培養用</td></tr><tr><td>A83-01</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72022</td><td>フォアブレイン培地 1 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Air コンプレッサー</td><td>Aerotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ロバ アンチチキン IgY (IgG) (H+L)</td><td>ジャクソン イムノ リサーチ</td><td>703-545-155</td><td>二次抗体、RRID:AB_2340375;希釈率1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A-31572</td><td>二次抗体、RRID:AB_162543;希釈率1:1000</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 crRNA、2 nmol</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td></td><td>カスタムデザイン(2 nmolとして注文)</td></tr><tr><td>Alt-R CRISPR-Cas9 tracrRNA</td><td>統合DNAテクノロジー</td><td>1072532</td><td>5 nmol</td></tr><tr><td>Alt-R S.p. HiFi Cas9 Nuclease V3</td><td>統合DNA技術</td><td>1081060</td><td>100 & マイクロ;g、Streptococcus pyogenes</td></tr><tr><td>Amphotericin B(Fungizone)</td><td>Gibco</td><td>15290018</td><td>Forebrain medium 2、3、および4から&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>抗GFP一次抗体(ニワトリ、ポリクローナル)</td><td>アブカム</td><td>ab13970</td><td>RRID:AB_300798;希釈率1:2000</td></tr><tr><td>抗PCGF4一次抗体(マウス、モノクローナル)</td><td>ミリポア</td><td>05-637&nbsp;</td><td>RRID: AB_309865; 希釈率 1:300</td></tr><tr><td>アポトーム 蛍光顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>アスコルビン酸</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>1043003</td><td>フォアブレイン メディウム 4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>B27-supplement (+ビタミンA)</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>Forebrain medium 3, 4&nbsp;&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>バナナからマイクログラバーへのケーブルキット</td><td>ハーバード装置 BTX</td><td>45-0216</td><td></td></tr><tr><td>Biometra TRIO-Thermocycler (PCR machine)</td><td>Analytik Jena</td><td>846-2-070-723</td><td></td></tr><tr><td>キャピラリー、フィラメント付きホウケイ酸ガラス、OD 1.2 mm;内径0.69 mm;長さ10cm</td>の<td>科学製品</td><td>BF120-69-10</td>特定の<td>厚さに引っ張る必要があります</td></tr><tr><td>CHIR-99021</td><td>STEMCELLテクノロジー72052</td><td></td><td>前脳媒体2&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>コラゲナーゼ IV 型</td><td>Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>CRTDi004-A</td><td>幹細胞工学施設 CMCB DD</td><td>https://hpscreg.eu/cell-line/CRTDi004-A</td> 健常ドナー DAPI Roche 10236276001の 1 mg/mL ストック<td>の単一細胞適応 hiPSC 株</td></tr>、IF ジブチリル <tr><td></td><td></td><td></td> cAMP <td>用に希釈した 1:1000 を使用</td></tr><tr><td></td><td>STEMCELL Technologies</td><td>73884</td><td>前脳中 4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>Forebrain medium 1, 2, and 3&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72102</td><td>前脳培地 1&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>Dumont #55 鉗子、ストライトス、11 cm</td><td>ファインサイエンスツール</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>ECM 830 矩形波エレクトロポレーションシステム</td><td>ハーバード装置 BTX</td><td>45-2052</td><td></td></tr><tr><td>エタノール</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32205-1L-M</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS-500G</td><td></td></tr><tr><td>ファストグリーン FCF</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F7252</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清 (FBS)</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>SH30070.03&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>フレーミング/ブラウンマイクロピペットプーラー</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td>マイクロキャピラリーの引っ張り用</td></tr><tr><td>Geneious Prime</td><td>GraphPad Software LLC d.b.a Geneious</td><td>Software version 2024.0.5</td><td></td></tr><tr><td>gLACZ</td><td>Kalebic et al., 2016;Platt et al., 2014</td><td></td><td>5'-TGCGAATACGCCCACGCGATCGG; 下線付きヌクレオチド = PAM</td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>35050038</td><td>前脳媒体 1, 2, 3, 4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8898<</td><td></td></tr><tr><td>em>gPCGF4 KO1</td><td>この論文</td><td></td><td>5'-TGAACTTGGACATCACAAATAGG (図 3I+J の KO 画像に対応)</td></tr><tr><td>gPCGF4 KO2</td><td>この論文</td><td></td><td>5'-ACAAATAGGACAATACTTGCTGG (KO図3I+J)</td></tr><tr><td>HEPES</td>は<td>、社内</td><td></td>で作られました1 <td>Mストック</td></tr><tr><td>馬血清、熱不活性化</td><td>Gibco</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>ヒトGDNF組換えタンパク質</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー450-10</td><td>前脳培地4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>ヒト/マウス/ラットBDNF組換えタンパク質</td><td>サーモフィ</td><td>ッシャー450-02</td><td>前脳培地4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>塩酸(HCl)</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>258148</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>ImmEdge(ワックス)ペン</td>を作るには ベクター<td>研究所</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>インスリン溶液 ヒト</td><td>シグマ・アルドリッチ</td><td>&nbsp;I9278</td><td>フォアブレイン・ミディアム 3&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>イソプロパノール</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>BP2618-1</td><td></td></tr><tr><td>ノックアウト血清補充</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10828-010</td><td>前脳中程度 1&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>レーザー走査型コンフォーカル980顕微鏡</td><td>ツァイス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低融点アガロース、</td><td>ビブラトーム切片化中にhCOを埋め込むための</td>超高純度<td>サーモフィッシャー</td><td>16520100</td></tr><tr><td>マトリゲル成長因子還元型(GFR)基底膜マトリックス、LDEVフリー</td><td>コーニング</td><td>354230</td><td>オルガノイド培養用</td></tr><tr><td>マトリゲルhESC認定マトリックス、LDEVフリー</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>hiPSC培養用</td></tr><tr><td>MgCl2、1 M</td><td>サーモフィッシャー</td><td>AM9530G</td><td></td></tr><tr><td>マイクロインジェクター PicoPump + フットスイッチ</td><td>ワールドプレシジョン機器</td><td>SYS-PV820</td><td></td></tr><tr><td>マイクロローダー ピペットチップ 0.5 〜 20 &micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>ガラス毛細血管のローディング用</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>幹細胞培地</td></tr><tr><td>N-2 サプリメント</td><td>Gibco</td><td>17502048</td><td>Forebrain 培地 2, 3&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NEB Next High Fidelity 2x PCR Mastermix&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>M0541S</td><td></td></tr><tr><td>ノイバウアー計数チャンバー</td><td>ブランド</td><td>718605</td><td></td></tr><tr><td>神経基礎培地</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>フォアブレイン培地4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>非必須アミノ酸</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11140050</td><td>前脳培地 1、2、3、4 (https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</sup</td></tr><tr><td>>ヌクレアーゼフリー デュプレックスバッファー</td><td>統合DNA技術</td><td>1072570</td><td></td></tr><tr><td>O. C. T. Compound</td><td>Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>凍結組織標本用埋込培地</td></tr><tr><td>P3 初代細胞 4D-Nucleofector X Kit S</td><td>Lonza</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド</td><td>フィッシャーケミカル</td><td>P/0840/53</td><td></td></tr><tr><td>pCAG-GFP</td><td>Addgene</td><td>11150</td><td></td></tr><tr><td>Peel-A-Way Embedding Mold TruncatedT12</td><td>Polysciences Inc.</td><td>18986-1</td><td>ビブラトーム用hCOの埋め込みおよび</td></tr><tr><td>ペニシリン-ストレプトマイシン(10,000 U/mL)</td>のクライオ切片用&nbsp;<td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Forebrain medium 1、2、3、および 4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15および核形成後の幹細胞培地用</td></tr><tr><td>ペトリ皿 60 mm x 15 mm、ベントなし、滅菌</td><td>Corning</td><td>BP50-02</td><td></td></tr><tr><td>ペトリ皿 プラチナ電極チャンバー、5 mm ギャップ</td><td>ハーバード装置 BTX</td><td>45-0504</td><td></td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)</td><td>自家製</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロテイナーゼ K</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P2308</td><td>Titrachiumアルバムから; 10 mg/mL ストック</td></tr><tr><td>QIAquick Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>RHO/ROCK pathway inhibitor (Y-27632)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72308</td><td></td></tr><tr><td>SB-431542</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72232</td><td>Forebrain medium 2&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr><tr><td>クエン酸ナトリウム二水和物</td><td>Σアルドリッチ</td><td>W302600-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)</td><td>シグマアルドリッチ</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖&nbsp;</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>スーパーフロスト プラス 接着スライド</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>SZX10 と KL 300 LED</td><td>オリンパス</td><td>SZX10</td><td>または代替ステレオスコープ</td></tr><tr><td>サーモ シェイカー</td><td>グラント</td><td>バイオ PSC24N</td><td></td></tr><tr><td>トリトン-X</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T9284</td><td>別名 オクトキシノール 9</td></tr><tr><td>トリズマ ベース</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>T1503</td><td>TrisHCl</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604021</td><td>Dissociation enzmye to make single-cell suspensions</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1379</td><td>a.k.a. Polysorbate 20</td></tr><tr><td>Tyrode's salt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T2145-10x1l</td><td></td></tr><tr><td>振動ミクロトーム(ビブラトーム)</td><td>ライカ</td><td>VT1200 S</td><td></td></tr><tr><td>ワイドボア 1000 & マイクロ;L ユニバーサルフィットフィルターチップ</td><td>コーニング</td><td>TF-1005-WB-R-S</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>ギブコ&nbsp;</td><td>21985-023</td><td>前脳中 1、3、4&nbsp;(https://doi.org/10.1016/j.stem.2020.02.002)15</td></tr></tbody></table>

遺伝子機能研究のためのスライスヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション

Electroporation of Sliced Human Cortical Organoids for Studies of Gene Function

CRISPR/Cas9を介した遺伝子アブレーションには、gRNAの設計が必要です。一般に、目的の遺伝子の最初のエクソンの1つを、7〜11 bpの間隔で配置したgRNAのペアで標的とすると(3 bpの倍数を避ける)、うまく機能します(図1A)。第1の試験として、gRNAによるテンプレート認識の効率は、PCRテンプレート26,40,62を用いてin vitroで調べることができる。効率的なターゲティングとCas9を介した切断は、テンプレートDNAの還元とアガロースゲル上の切断されたDNA産物の出現に見られます(図1B)。皮質オルガノイドの生成に使用されるiPS細胞株では、さらなるgRNA試験を行うことができます。これにはiPS細胞のヌクレオフェクションが必要であり、これは蛍光レポーターの発現が成功することで可視化できます(図1C)。目的の遺伝子座の効率的なターゲティングは、サンガーシーケンシングによって検証することができ、その結果、標的部位の周囲で突然終了するか、または重ね合わせるクロマトグラム(図1D)が得られ、これは非相同末端結合による二本鎖切断修復からのインデルのスペクトルから生じる66。Guide RNA効率試験は、in vitroおよびiPSC細胞で、皮質オルガノイドの遺伝子アブレーションに有効なgRNAペアを選択するのに役立ちます。
エレクトロポレーションに先立って、皮質オルガノイドをスライスし、エレクトロポレーションミックスを注入するための心室内腔の同定をサポートします(図2A-C)。次に、注入されたオルガノイドをエレクトロポレーションチャンバーに移します(図2D)。エレクトロポレーションには、心室様構造の良好な皮質オルガノイドを使用し(図2E)、目に見える構造を持たない皮質オルガノイドは廃棄する必要があります(図2F)。エレクトロポレーションミックスには、処置中に注入された心室を視覚化できる色素が含まれています(図2G)。培養で1〜3日後、蛍光顕微鏡下でネイティブGFPシグナルにより、標的化に成功した心室が見えます(図2H)。
詳細な組織学的分析のために、凍結切片の免疫組織化学を行うことができます。理想的には、エレクトロポレーションされた皮質オルガノイド内に複数の標的心室が存在する(図3A、B)。最も最適なエレクトロポレーションは、オルガノイドの外側領域にある心室様構造を標的とし(図3C)、これらは通常、最も拡張した心室です。場合によっては、プラスミド濃度が高すぎる場合やエレクトロポレーション設定が最適でない場合など、エレクトロポレーションが過剰な細胞死につながる可能性があります(図3D、E)。オルガノイドの内部に面したエレクトロポレーション(図3F)は、多くの場合、外部と比較して心室様構造の拡張領域が少ないです。私たちの経験では、オルガノイドの定義された領域に定量分析を集中させることで、ばらつきを減らすことが有効です。エレクトロポレーションは、注入量が多すぎて心室が破裂したり、電気パルスが強すぎて細胞の層間剥離を引き起こしたりするなど、頂端表面の破壊を引き起こすことがあります(図3G)。最後に、隣接する2つの心室が標的とされると(図3H)、皮質ゾーンの境界と標的細胞の起源を割り当てることが困難になる可能性があります。
免疫組織化学は、目的細胞(図3I)におけるタンパク質レベルでのCRISPR/Cas9媒介ノックアウトの成功を検証するために使用され、ここではPolycomb Repressive Complex 1(PRC1)タンパク質PCGF467を標的とすることによって例示されています。シグナル強度は、対照細胞と実験条件でGFP陽性細胞で分析できます(図3J)。あるいは、適切な抗体が利用できない場合、標的細胞を皮質オルガノイド60 からFACSによって単離し、さらにサンガーまたは次世代シーケンシング36によって分析することができる。さらに、タンパク質レベルの減少は、ウェスタンブロッティングを使用して分析することもできます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig1v5.jpg"> 
図1:急性CRISPR/Cas9媒介遺伝子ノックアウトのためのガイドRNAの設計と検証 (A)ガイドRNA(gRNA)設計戦略の概略図、目的遺伝子のエクソンを標的とする2つのgRNAを使用。黒矢印は、gRNAバリデーションに使用されるテンプレート調製用のPCRプライマーを示しています。(B) in vitroでのgRNA効率の検証。PCR増幅されたテンプレートは、RNP複合体で消化されました。切断が成功すると、ゲル電気泳動後にサイズの異なる2つのバンドが見えますが(左)、低効率のgRNAではテンプレートがカットされないままです(右)。(C)RNP複合体とGFPプラスミドを用いたヌクレオフェクション3日後のヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)の明視野画像(左)、GFP蛍光(中央)、および結合画像(右)。スケールバー:350 μm. (D) GFP陽性細胞からの増幅DNAのサンガーシーケンシングによるhiPSCにおけるgRNA効率の検証。二本鎖DNAの切断が成功すると、シーケンシングトラックはgRNA標的部位から始まるシグナルの重ね合わせを示します(上、KO1)。ターゲティングに失敗した場合、DNA配列のトラックは LACZ コントロールと比較して変化しません(下、KO2)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig2v5.jpg"> 
図2:スライスしたヒト皮質オルガノイドのエレクトロポレーション (A)ヒト皮質オルガノイド(hCO)のエレクトロポレーションのワークフローを示す概略図。まず、hCOを厚さ500μmのスライスに切片化します。2日後、GFP発現プラスミドとFast Greenを含むRNPミックスを、hCOの外側領域に優先的に、心室様構造の内腔に注入します。エレクトロポレーションでは、hCOをエレクトロポレーションチャンバーに入れます。数日間の培養後、エレクトロポレーション領域でGFPシグナルを検出することができます。(B)hCOのビブラトーム切片化の画像。オルガノイドは、ブロック内の培地中の3%低融点アガロースに埋め込まれています(左)。ブロックを厚さ500μmのスライスに切断します(中央)。スライスされたオルガノイドは、ワイドボアピペットチップ(右)で培養皿に戻されます。(C<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig02large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67598/67598fig3v5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67598/67598fig03large.jpg" target="_blank"></a><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Human cortical organoids have become important tools for studying human brain development, neurodevelopmental disorders, and human brain evolution. ...

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