虚血性脳卒中のラットモデルにおける免疫蛍光法による細胞死シグナル伝達の評価

虚血性脳卒中は、世界中で死亡および障害の主な原因です。私たちの研究は、脳卒中の薬物標的に焦点を当てています。私たちは、RUNX1やカテプシンなど、いくつかの新たな標的に関心を持っています。これらの標的を評価するために、中大脳動脈を閉塞することにより、虚血性脳卒中のラットモデルを開発しました。

中大脳動脈を閉塞するフィラメントを挿入することにより、ラットの虚血性脳卒中をモデル化します。中大脳動脈閉塞モデルは、TTC、免疫蛍光法、TUNEL 染色などの他の技術と組み合わせた前臨床脳卒中研究で最も一般的に使用されるげっ歯類モデルです。脳卒中の病態生理学を統合的なアプローチで探求することができます。免疫蛍光には、抗体の特異性、蛍光のバックグラウンドの最小化、蛍光標識と特異的抗体の特性を利用して信号対雑音比を最適化するなど、いくつかの技術的課題があります。免疫蛍光法により、細胞構造の複雑な状況と、中大脳動脈閉塞モデルとの分子相互作用を理解することができます。

脳卒中の適切な時間枠があれば、多くの脳組織が救済できる可能性があります。その結果、カテプシンBの発現は、中大脳動脈閉塞後のラット脳の数で活性化されることを示しました。それはアポトーシスの増加を伴います。細胞死シグナル伝達の根底にあるメカニズムに関するさらなる研究は、薬物の新しい標的を利用する可能性があります。

今後の研究では、炎症経路と細胞死シグナル伝達における潜在的な分子標的の探索を続けていきます。実験的研究によって発見されたこれらの標的の一部が臨床治療に変換され、それによって脳卒中患者の生存率と生活の質が向上することを願っています。

[ナレーター]まず、麻酔をかけたラットを仰臥位に置き、調整されたヒートマットと直腸温度モニタープローブを使用して体温を36.5°Cに維持します。首の皮膚を剃り、ヨードフォア消毒液を使用して消毒します。次に、首に2cmの正中線切開を行い、軟部組織を引っ込めて頸動脈血管を露出させます。鉗子を使用して、右総頸動脈 (CCA)、外頸動脈 (ECA)、および内頸動脈 (ICA) を分離します。縫合糸を使用して右近位 CCA を結紮します。次に、右ICAとECAをマイクロクリップで原点でクランプします。丸いシリコンチップでコーティングされたナイロンモノフィラメントを小さな切開からCCAの内腔に挿入し、CCAに結び目を作り、モノフィラメントの出血や脱落を防ぎます。右ICAマイクロクリップを開き、シリコンチップがMCAの起点を塞ぐまで、ICA断端を通して右中大脳動脈(MCA)にモノフィラメントを挿入します。ナイロンモノフィラメントの露出部分を切り取り、正中線の首の切開部を閉じます。MCA閉塞を2時間行った後、首の切開を開き、CCAの結び目をほどきます。次に、ナイロンモノフィラメントを引き抜いてMCAを再灌流します。手術後、温度調節された加熱マットで維持された加熱ケージで麻酔からの回復中のラットを観察します。Zaya Long Behavioral Rating Scale を使用して、中大脳動脈閉塞 (MCAO) の 2 時間後、および再灌流後 22 時間の神経機能を評価します。MCAOモデルラットから全脳を単離した後、脳を-20°Cで20分間凍結します。凍結した脳を、スライス間の距離を2mmの6つの冠状スライスに切ります。スライスを2%TTCで暗所で37°Cで15分間染色します。次に、脳のスライスを室温で4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。クローズアップオブジェクトのオートモードに設定されたデジタルカメラを使用して、汚れたスライスを撮影します。画像をコンピューターに転送し、ImageJ ソフトウェアを使用して梗塞サイズを測定します。梗塞サイズは、6つのスライスすべての梗塞面積の合計と、同じスライスの脳全体の面積の合計の比率として計算します。偽のグループでは梗塞がなかったのと比較して、MCAO グループでは有意な梗塞領域が観察されました。免疫蛍光分析のために、MCAOモデルラットの無傷の脳を4%パラホルムアルデヒドで24時間固定します。次に、10%、15%、30%濃度、10%、15%、30%濃度の一連のスクロース溶液勾配で脳を脱水し、組織が沈むまで続けます。脱水した脳を最適な切断温度コンパウンドに埋め込み、気泡を取り除きます。液体窒素で脳をスナップ凍結します。クライオスタットで、5μmの厚さで脳を切片します。凍結した脳切片を室温で平衡化した後、滅菌PBSでそれぞれ5分間3回洗浄します。免疫組織化学ペンで組織の輪郭を描いてから、1mLあたり20 μgのプロテイナーゼKおよび0.3%Triton X-100と室温で10分間インキュベートします。切片をPBSで洗浄した後、輪郭を描いた組織に3%BSAを塗布し、室温で1時間インキュベートしてブロッキングします。ブロッキング溶液を適切な一次抗体に置き換え、切片を暗所で4°Cで一晩インキュベートします。 翌日、0.1%Tween-20を含む滅菌PBSで切片を5分間3回洗浄します。必要な蛍光色素に結合した適切な二次抗体を加え、切片を加湿チャンバー内で1時間インキュベートし、光から保護します。Tween-20を含むPBSで切片を洗浄した後、DAPPIを含む封入剤で染色し、カバースリップで覆います。蛍光顕微鏡で、励起波長を488 nm、発光波長を520 nm、露光時間を500 msに設定して、染色された脳切片をキャプチャします。年齢。カテプシンBの免疫反応性は、偽のグループと比較して、MCAOグループの虚血コアで有意に増加しました。カテプシンBの免疫反応性は、偽のグループと比較して、MCAOグループの半影皮質で有意に上昇しました。虚血性コアと半影皮質の間でカテプシンB免疫反応性に有意差は観察されませんでした。まず、MCAOモデルラットのパラホルムアルデヒド固定脳スライスを、それぞれ35〜50分間エタノール濃度を上昇させて脱水します。次に、脳スライスをテレビン油タイプの透明な生物学的製剤1で35〜50分間処理し、続いて組織が完全に透明になるまで透明剤2を35〜50分間処理します。次に、脳スライスを包埋培地1、2、3、および4にそれぞれ60分間連続して浸します。脳スライスを包埋カセットに入れ、しっかりと密封し、固化のために冷蔵保管します。ミクロトームを使用して、組織ブロックを10 μmでトリミングし、次に5 μmでスライスします。組織切片を45°Cのウォーターバスに30秒間浮かせてから、スライドに移します。乾燥後、脳切片を透明化剤でそれぞれ10分ずつ2サイクル脱パラフィンします。次に、エタノール濃度を下げて脳切片を再水和します。次に、セクションをPBSで5分間3回すすぎます。余分な水分を取り除いた後、各切片に100 μLのプロテイナーゼKを加え、37°Cで20分間インキュベートします。PBS洗浄後、100 μLの末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ平衡化バッファーを各サンプルに適用し、37°Cの加湿チャンバーで10〜30分間インキュベートします。吸収紙を使用してバッファーを取り除き、TUNELアッセイキットから50 μLの標識作業溶液を加えます。次に、DAPPI作業溶液を切片に塗布し、暗所で5分間インキュベートして核を対比染色します。サンプルをPBSで4回、それぞれ5分間すすぎます。余分な液体を取り除き、色あせ防止封入剤でスライドを密封します。Vectra Polarisマルチスペクトルイメージングシステムを使用して染色されたスライドをスキャンします。TUNEL染色では、偽のグループと比較して、MCAOグループの半影皮質にTUNEL陽性細胞が多く、アポトーシスの有意な増加が示されました。