Name: 老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: 学ぶミトコンドリア形態のイメージングと定量化法。C. elegansを用いて老化過程における組織特異的ミトコンドリア構造変化を可視化し、蛍光顕微鏡とFiji解析で再現性のあるデータを取得する方法です。

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<meta charset="utf8"></head><body>C. elegansのミトコンドリア形態の解析

<table><tbody><tr><td>5-フルオロ-2'-デオキシウリジン (FUDR)</td><td>Spectrum Chemical</td><td>F2026-10GMBL</td><td>増殖阻害用</td></tr><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>RNAi バ</td></tr><tr><td>クト寒天</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>NGM プレート用</td></tr><tr><td>バクトペプトン</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>NGM プレート用</td></tr><tr><td>塩化カルシウム二水和物</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>RNAiコレステロール</td>用<td>カルベニシリン</td><td>VWR</td><td>76345-522</td></tr><tr><td></td><td>NGMプレート用</td><td>VWR</td><td>80057-932</td></tr><tr><td>共焦点顕微鏡&nbsp;</td><td>ステラリス5</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>薬用溶剤</td></tr><tr><td>HistoBond 顕微鏡スライド</td><td>VWR</td><td>16005-110</td><td>スライド用 準備</td></tr><tr><td>LB ブロス</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>LB</td></tr><tr><td>ライカ S7E 解剖スコープ</td><td>ライカ</td><td>10450840</td><td>標準解剖顕微鏡</td></tr><tr><td>ライカ ステラリス 5</td><td>ライカ</td><td>158101100</td><td>共焦点顕微鏡</td></tr><tr><td>ライカサンダー</td><td>ライカ</td><td>11525679</td><td>化合物顕微鏡</td></tr><tr><td>NGMプレート用硫酸マグネシウム七水和物</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>、M9</td></tr><tr><td>pL4440 エンプティベクタープラスミド</td><td>addgene</td><td>プラスミド #1654</td><td>エンプティベクタープラスミド</td></tr><tr><td>塩化カリウム</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>漂白剤用ソルトン</td></tr><tr><td>カリウムリン酸二塩基性</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>NGMプレート用</td></tr><tr><td>リン酸カリウム一塩基性</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>M9</td></tr><tr><td>アジ化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>麻痺ワーム用</td></tr><tr><td>塩化ナトリウム</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>NGMプレート用、M9</td></tr><tr><td>次亜塩素酸ナトリウム</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td>漂<td>白剤溶液用</td></tr><tr><td>リン酸ナトリウム二塩基性</td><td>VWR</td><td>71003-472</td><td>M9</td></tr><tr><td>テトラサイクリン塩酸塩</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>RNAi</td></tr><tr><td>WOB-L&not;&Aリグ;ドライ真空ポンプ、標準デューティ、ウェルチ&not;&Aリグ;</td><td>吸引用</td><td>VWR80077-612</td><td></td></tr></tbody></table>

老化中の c.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

Imaging and Quantifying Mitochondrial Morphology in C. elegans During Aging

C.エレガンスは 、その透明なボディにより、過剰なサンプル調製なしに、ミトコンドリアの生きた動物の全粒イメージングを容易にするため、ミトコンドリアイメージングの優れたモデルです。さらに、組織特異的なプロモーターを使用してミトコンドリアを標的とする蛍光タンパク質を発現させることで、さまざまな組織のミトコンドリアの形態を簡単に視覚化できます。ここでは、 myo-3p (筋肉ミトコンドリア)、 vha-6p (腸内ミトコンドリア)、 col-19p (皮下ミトコンドリア)を利用して、ミトコンドリアを標的とするGFP(ATP-1タンパク質のミトコンドリア局在配列)の発現を促進しました。 C.エレガンスの 体壁筋のミトコンドリアは、筋線維(筋原線維)に沿って整列する管状の形態を示します(図1A)。腸のミトコンドリアは、高度に相互接続されたクモの巣状の構造を示し、均一な整列は少なかった(図1B)。また、皮下組織には、腸や筋肉に比べて丸みを帯びた、または楕円形に見える管状のミトコンドリアがあります(図1C)。ミトコンドリアの形態は、一般に、筋肉と腸の線虫の長さにわたって一貫していますが、皮下組織では、線虫の近位端と遠位端の間のミトコンドリアの相互接続性にいくつかのわずかな違いが見られます。したがって、再現性のある実験結果を得るためには、彼らの体の特定の領域に焦点を当てることをお勧めします。ここでは、咽頭と外陰部の間の領域、咽頭の下100~200μmの領域が一貫して画像化されています。
筋肉および皮下ミトコンドリアの場合、複合顕微鏡でイメージングすると、細胞の平坦性と焦点の合っていない光のレベルが低いため、十分な解像度が得られます。しかし、腸内のミトコンドリアは、腸の他の部分からのボケ光が多量に当たるため、腸の体積が大きいため分解能が制限されるため、複合顕微鏡で観察することは困難です(図2)。したがって、共焦点顕微鏡で腸のミトコンドリアを画像化して、焦点の合っていない光を減らし、適切なミトコンドリアの形態を視覚化することをお勧めします。
ミトコンドリアの形状は非常に動的であり、動物の代謝環境23 に基づいて、あるいは変動する基質の硬さ24への曝露によってさえ変化する。したがって、動物を食物源がない状態で顕微鏡スライド上に長時間放置したり、ガラスの硬い基板に放置したりすると、ミトコンドリアの形態に影響を与える可能性があります。この研究では、線虫のミトコンドリアは、M9溶液中のスライド上で約30分後に断片化し、皮下ミトコンドリアが最も断片化を示すことがわかりました(図3)。したがって、ミトコンドリアのイメージングは、サンプル調製後速やかに行う必要があります。
C .エレガンスのライブイメージングには、アジ化ナトリウムやテトラミソールなど、線虫の移動性を制限する化学物質が一般的に使用されています。これは、静止した線虫が3Dイメージングのために動物の複数のz切片を撮影する必要があるためです。以前の研究では、アジ化ナトリウムまたはテトラミソールへの曝露がミトコンドリアの断片化を引き起こす可能性があることが示されています25。驚くべきことに、アジ化ナトリウムは、高濃度であっても、筋肉や腸のミトコンドリアの形態に限られた影響を与えることがわかりました。しかし、皮下組織では、M9コントロールよりも早いミトコンドリア断片化が示されました(図3)。重要なことに、高濃度のテトラミソール(100 mM)は、すべての細胞タイプでばく露直後に有意なミトコンドリア断片化をもたらしました。これに対し、中濃度(10 mM)では、M9コントロールと比較してフラグメンテーションが速くなりました。低濃度(1 mM)は、ミトコンドリアの形態に限定的な影響を与えました。これらのデータは、アジ化ナトリウムの利用がミトコンドリアの迅速なイメージングのための実行可能な選択肢であり得る一方で、テトラミソールは一般的に避けるべきであることを示唆しています。
予想通り、 C.エレガンス のすべての組織のミトコンドリアは、自然な老化プロセス中に断片化を示します(図4A)。断片化は、ミトコンドリアがより切り詰められた球形の構造として現れるものとして視覚化でき、これは若い動物に見られる線形の管状のミトコンドリアとは劇的に異なります。腸は後年で球状の自己蛍光構造が増加するため、自家蛍光と実際のミトコンドリア構造を混同しないように注意する必要があることに注意することが重要です。ミトコンドリア構造の変化には線虫間でばらつきがある可能性があるため、数本の線虫をイメージングするのではなく、かなりのサンプルサイズでミトコンドリアの形態の定量化を行うことが重要です。ここでは、オブジェクト、ネットワーク、ネットワークあたりのジャンクション、ジャンクションポイント、オブジェクトの長さ、ミトコンドリアフットプリント、ミトコンドリアカバレッジ、オブジェクト面積など、さまざまな指標を使用してミトコンドリアの形態を自動的に定量化できるmitoMAPRを使用しました(補足表1 および 補足表2)。自動化により、ユーザーから主観的な偏見が取り除かれます。ここでは、老化時の筋肉や腸のミトコンドリア形態の変化を定量的に測定するには物体長メトリクスを、老化時の皮下ミトコンドリア形態の変化を測定するにはジャンクションポイントメトリクスが最適であることを報告します(図4B)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig01.jpg"> 
図1: C.エレガンスの全身にわたるミトコンドリアの画像。 ミトコンドリアイメージングは、筋肉(A)、腸(B)、および皮下組織(C)でMLS::GFPが発現するトランスジェニック動物において、L1段階からEVで増殖した成体動物5日目の全長にわたって実施された。スケールバー:100μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig02.jpg"> 
図2:化合物顕微鏡と共焦点顕微鏡のミトコンドリアイメージングの比較。 ミトコンドリアイメージングは、筋肉(A)、腸(B)、および皮下組織(C)にMLS::GFPが発現するトランスジェニック動物のL1段階からEVで成長した1日目の成体動物で実施されました。スケールバー:5μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig03.jpg"> 
図3:M9、アジ化ナトリウム、およびテトラミソールによる処理後のさまざまな組織のミトコンドリア断片化の評価。 ミトコンドリアイメージングは、1日目の成体動物で行い、筋肉、腸、皮下組織にMLS::GFPを発現させました。動物はL1段階からEVで育てられました。M9、アジ化ナトリウム(1 mM、10 mM、100 mM)、またはテトラミソール(1 mM、10 mM、100 mM)を含むスライド上に動物を配置し、スライド調製直後(0分)またはスライド調製の15分後または30分後にイメージングを行いました。代表的な画像は、2回の生物学的複製について、系統あたりn匹&gt;5匹の動物について示されています。スケールバー:5μm。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67610/67610fig04.jpg"> 
図4:さまざまな組織での老化中の C.エレガンスの ミトコンドリアイメージングとMitoMAPRを使用したミトコンドリア形態の定量化。 (A)ミトコンドリアイメージングは、成体動物の成体動物において、成人期の1、5、9、13、および15日目に行われ、筋肉、腸、および皮下組織にMLS::GFPが発現しました。動物はL1段階からEVで成長し、1日目の成体段階からFUDRを含むEVプレートに移動しました。画像は、≥ 3 回の生物学的複製について、系統あたり n ≥ 5 匹の動物を代表しています。スケールバー:5μm。(B)1日目、5日目、9日目、13日目、15日目の線虫の筋肉ミトコンドリアと腸内ミトコンドリアの物体長の定量化、および1日目、5日目、9日目、13日目、15日目の線虫の皮下ミトコンドリアの接合点の定量化。すべての個々のデータポイントと平均±SDを組み合わせたグラフをプロットし、スチューデント t検定を使用して統計的に分析しました。ns = 有意ではない, *p &lt; 0.03;**p &lt; 0.002;p &lt; 0.0002;p &lt; 0.0001 です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>ワームの日々</td>
			<td>ワームの数</td>
			<td>緩衝液容量(mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1</td>
			<td>25</td>
			<td>13</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>25</td>
			<td>14</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>9</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>13</td>
			<td>20</td>
			<td>15</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:スライドを準備する際の推奨ワーム数とバッファーの量。
補足図1:MitoMAPRを使用した単一画像定量化の適用と複数の画像のバッチ処理のワークフロー。 (A)MitoMAPRマクロを用いて1枚の画像からミトコンドリアの形態を定量化するワークフロー。(B)フィジーを使用した生の3D画像ファイルのZ投影(Max投影)。(C)Z投影画像から関心領域を切り抜く。(D)MitoMAPRマクロから取得した骨格画像。スケールバー:5μm。(E) MitoMAPRマクロを用いたバッチ処理により、複数の画像からミトコンドリアの形態を定量化するワークフロー。(F)クロップマクロのスクリーンショット。(G)Z投影のバッチ処理のスクリーンショット。(H)バッチトリミングマクロの選択確認ウィンドウのスクリーンショット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1: C.エレガンス 筋肉組織におけるミトコンドリア形態指標の定量的分析。 記録されるメトリクスには、オブジェクト、ネットワーク、ネットワークあたりのジャンクション数、ジャンクションポイント、オブジェクトの長さ、ミトコンドリアフットプリント、オブジェクト面積、ミトコンドリアカバレッジなどがあり、これらは異なる日間で測定されます。データは、加齢に伴うミトコンドリアの形態の変化を評価するための基礎となります。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2: C.エレガンスのミトコンドリア形態に対する固定化化学物質の影響。 データには、M9バッファーまたは異なる濃度のテトラミソールとアジ化ナトリウムを使用したサンプル調製後のさまざまな濃度と時点におけるオブジェクト、ネットワーク、ネットワークあたりのジャンクション、ジャンクションポイント、オブジェクトの長さ、ミトコンドリアフットプリント、オブジェクト面積、ミトコンドリアカバレッジなどの測定値が含まれます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67610/67610_Supplementary%20Table%202.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

老化中の C.エレガンス におけるミトコンドリア形態のイメージングと定量化

Mitochondria, important cellular organelles found in most eukaryotic cells, are major sites of energy production through aerobic respiration. Beyond this ...

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学ぶミトコンドリア形態のイメージングと定量化法。C. elegansを用いて老化過程における組織特異的ミトコンドリア構造変化を可視化し、蛍光顕微鏡とFiji解析で再現性のあるデータを取得する方法です。

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