緑 膿菌 および 黄色ブドウ球 菌の不均一な表現型のタイムラプス落射蛍光顕微鏡イメージング

私たちの研究室では、なぜ抗生物質が効かないのかを研究しています。特に、抗生物質によって死滅すると思われている細菌集団の残留性と呼ばれる少数の細胞に関心がありますが、それらは抗生物質治療を生き残ることができます。そして、これらの持続性物質は、抗生物質治療が終了した後に感染症を再発させると考えられています。

そのため、これらの持続性の遺伝子発現と代謝を調べて、彼らの生存戦略をよりよく理解することに興味があります。パーシステンスタ分野の現在の課題は、スループットとシングルセル感度のバランスを取ることです。私たちは、治療後に単一の細胞が分裂する能力を一致させる必要があります。これにより、細胞は持続性として認定され、細胞の内部の働きを理解するのに役立つ測定可能な表現型とを一致させる必要があります。

そして、1つの永続性物質を捕捉するためには、何千もの細胞に対してこれを行う必要があるかもしれません。私たちのプロトコルは、技術的に困難な不正確な寒天サンドイッチ法やマイクロ流体デバイスの製造と比較して、簡単に実装できるように開発されました。私たちのプロトコルは、最小限の材料で長期にわたって再現性のある安定したイメージングを実現するため、費用対効果が高く、高品質のデータ収集のための無駄が最小限に抑えられることがわかりました。

今後の研究では、オミクスとシングルセルアプローチを組み合わせて、病原体がさまざまなクラスの抗生物質による治療にどのように反応し、治療から回復するかを研究します。私たちの最終的な目標は、この理解を活用して、臨床感染症の治療を改善するための新しい戦略を開発することです。まず、滅菌済みの30ミリメートルカバースリップを、交換可能なカバースリップディッシュのステンレス鋼ベースの底に置きます。

ポリカーボネートインサートをベースにそっとねじ込み、カバースリップがチャンバーのベースを形成することを確認し、付属のシリコンOリングを圧縮して所定の位置に密封します。カスタム3Dプリントされた仕切りを30ミリメートルのカバースリップに当てて、モーダルセルが交差汚染するのを防ぎます。選択した媒体を使用して、50ミリリットルの円錐管に1.5%アガロースを調製し、穏やかに渦巻いて混合します。

円錐形チューブのキャップを緩め、ガラスビーカーまたは電子レンジ対応ホルダーに入れます。アガロース混合物を電子レンジで加熱し、3〜4秒ごとに停止して渦巻き状に混合し、泡立ちを防ぎます。1分後、混合物に溶けていないアガロースが残っているかどうかを確認します。

均一に透明な場合は、アガロースを摂氏約60度まで短時間冷却します。関連する抗生物質またはダイスを追加し、泡の形成を避けて、穏やかに渦を巻いて混合します。2ミリリットルのアガロースを30mmのカバースリップでチャンバーにピペットで入れます。

滅菌済みの25ミリメートルカバースリップを上部チャンバー開口部のアガロースにそっと置きます。パッドが固まるまで1〜2時間待ちます。パッドが固まったら、先端の細い油性マーカーを使用して、25ミリメートルのカバースリップに各サンプルの位置と識別をマークします。

ステンレス製のベースリングが上を向くようにチャンバーを反転させ、ベースを緩めながらポリカーボネートインサートを慎重に下に保持します。ステンレス製のベースを脇に置きます。30mmカバースリップをアガロースパッドからスライドさせて外し、廃棄します。

PBSで緑膿菌または黄色ブドウ球菌の細胞培養物を、単一細胞の可視化に適したまばらな密度に希釈します。ピペットで激しく上下に動かし、細胞を均等に分散させます。希釈した細胞懸濁液の5マイクロリットルを、アガロースパッドのマークされた位置に見つけます。

スポットが乾いたら、新しい滅菌30ミリメートルカバースリップをパッドの上に置きます。次に、ポリカーボネートインサートを片手で持ち、カバースリップの上にステンレス鋼ベースをゆっくりとねじ込み直します。チャンバーが密閉されたら、アガロースが30ミリメートルのカバースリップの表面に接触しているかどうかを確認します。

ピンセットの鈍い端を使用して、アガロースが30mmカバースリップの表面全体に均等に触れるまで、25mmカバースリップをそっと押します。まず、ステージトップインキュベーターとラージチャンバーインキュベーターの温度を摂氏37度に設定して、顕微鏡とイメージングチャンバーの環境制御を準備します。次に、チャンバー加湿器の電源を入れます。

1つのアガロースパッド調製物をステージトップインキュベーターに入れ、チャンバーを閉じて平衡化させます。画像取得用にMetaMorphソフトウェアを準備するには、内蔵のオートフォーカスアルゴリズムを、多次元取得時に位相チャネルを使用するように設定します。「ステージ」タブでは、各サンプルに複数のステージ位置を設定し、セル密度が均一に分布する視野をターゲットにします。

次に、[タイムラプス]タブで、画像取得の時間と頻度を設定します。「Wavelengths」タブで、取得に必要なチャンネルを設定し、サンプルの信号強度に基づいて露光時間を調整します。アガロースパッドがチャンバー内で温まったら、加湿蓋をステージ上部のインキュベーターに置きます。

次に、顕微鏡で、位相コントラストから微分干渉コントラストモードに切り替えます。コンデンサーと絞りダイヤフラムを調整して、適切なKohler照明を実現します。調整が完了したら、位相差モードに戻します。

各ステージ位置に移動し、フォーカスを調整して、ステージ位置を新しい焦点面にリセットします。「Acquire」ボタンをクリックして、多次元集録を開始します。取得後、画像をコンパイルするには、MetaMorph を開き、Review Multidimensional Data アプリを使用して目的のチャンネルまたは波長を選択し、各ステージ位置のすべての時点を含めます。

[Load Images] をクリックし、各コンピレーションをそれぞれのチャンネル名で TIFF ファイルとして保存します。黄色ブドウ球菌細胞のタイムラプスイメージングを行い、抗生物質治療の進行に伴うヨウ化プロピジウムの染色を示し、膜の損傷を示しました。抗生物質治療中の緑膿菌のイメージングでは、ヨウ化プロピジウム染色を伴う球状形成、フィラメント形成、および細胞質凝縮を受ける細胞が示されました。

アガロースパッドの調製とイメージング条件の成功により、抗生物質治療から回復した黄色ブドウ球菌と抗生物質治療から回復した緑膿菌を観察し、単一細胞に由来する大きなクラスターを形成することができました。