解剖された幼生ゼブラフィッシュの神経筋接合部におけるシナプス小胞のリサイクルのライブイメージング

私たちは、ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部をモデルシステムとして、シナプス伝達の分子的および細胞的メカニズムを研究しています。私たちは、様々な生理学的・病理学的条件に対するシナプスの調節調節を明らかにすることに興味を持っています。このプロトコルにより、ゼブラフィッシュの幼生の神経筋接合部における活動電位誘発性の新たな伝達を、感度を向上させて可視化することができます。

中程度の刺激によって誘発されるシナプス機能をモニターすることができますが、これはこれまで検証されたことがありません。このイメージングプロトコルは、従来の落射蛍光顕微鏡で実施でき、必ずしも共焦点レーザー走査型顕微鏡は必要ありません。言い換えれば、この方法は、他の実験装置と比較して、神経筋機能をイメージングするための費用対効果の高いプラットフォームを提供します。

200ミリリットルの細胞外溶液を調製するには、6.4ミリリットルの3.5モル塩化ナトリウム、0.4ミリリットルの1モル塩化カリウム、1ミリリットルの1モルHEPES、0.4ミリリットルの1モル塩化カルシウム、0.2ミリリットルの1モル塩化マグネシウム、および360ミリグラムのグルコースを混合します。次に、超純水を加えて総容量を200ミリリットルにします。20マイクロリットルの15ミリモルD-ツボクラリンストック溶液を添加して、3マイクロモルのD-ツボクラリンを含む100ミリリットルの細胞外溶液を調製します。

0.02%トリカインを含む25ミリリットルの細胞外溶液を調製するには、0.5ミリリットルの1%トリカイン原液を25ミリリットルの溶液に加えます。マイクロピペットプーラーを使用して、先端の直径が3〜10マイクロメートルの範囲に収まるまでシータガラスキャピラリーを引っ張ります。ピペットに細胞外溶液を入れます。

キャピラリーの各開口部に細い白金線を挿入し、シータガラスピペット電極を電動マイクロマニピュレーターのピペットホルダーに保持します。次に、各ワイヤの後端を刺激アイソレータに接続します。0.02%トリカインを含む25ミリリットルの細胞外溶液をガラスのペトリ皿に入れるには、ゼブラフィッシュの幼虫をペトリ皿に移して解剖します。.

2つの細い鉗子を使用して、幼虫の皮膚をはがします。最初の鉗子を使用して幼虫を所定の位置に保持し、他の鉗子で水泳膀胱の背側の皮膚をつまみます。次に、メスを使用して、水泳用膀胱、内臓、および頭を取り出します。

先端がファイヤーポリッシュ仕上げのガラス製パスツールピペットを使用して、解剖したゼブラフィッシュのサンプルをイメージングチャンバーに移します。C字型のプラチナワイヤーに接着されたナイロン糸でサンプルを機械的に固定し、刺激電極とほぼ平行な角度でサンプルを向けます。重力流システムを使用して、毎分1ミリリットルの速度でサンプルを灌流し、3マイクロモルのD-ツボクラリンを含む細胞外溶液を使用します。

次に、刺激電極を脊髄に挿入します。脊髄の腹側に位置するTagRFP陽性ニューロンとして識別される脊髄運動ニューロンの近くに電極先端を慎重に配置します。隣接するセグメントから目標位置まで電極を斜めに進めます。

コンピュータで開始するには、TagRFP蛍光のライブ画像に基づいてイメージング領域を選択します。選択した領域に複数のボタンが含まれ、ボディ セグメント境界付近のブートンが除外されていることを確認します。イメージング用の蛍光フィルターユニットGFPフッ素蛍光を切り替えます。

次に、光源の強度を調整して、飽和のない1ヘルツのタイムラプスモードで明るい画像を取得します。micromanager ウィンドウの exposure ミリ秒 フィールドに、露出時間を 100 に入力します。画像取得ソフトウェアとデジタル入力出力デバイスを設定して、画像取得を電気刺激と同期させます。

次に、Arduinoスクリプトで、画像取得の開始から刺激配信までの刺激周波数、活動電位の数、および時間遅延を決定します。これらの設定に基づいて、取得に必要な画像の総数を計算し、この値をMicroManagerの多次元取得ウィンドウのカウントフィールドに入力します。1ヘルツのタイムラプス撮影の間隔フィールドに1秒間隔を設定します。

電気刺激の場合は、70 mV の 1 ミリ秒の定電圧パルスを送達するように刺激アイソレータを構成します。デジタイザコマンドを実行して、画像取得を開始します。プロセスをモニタリングして、許容できない画像ドリフトがないこと、およびフッ素と応答が観察できることを確認します。

パルス数の周波数など、刺激強度を変更したり、実験目的に基づいて温度を調整したりします。タイムラプス画像をTIFF時系列スタックとして保存します。シグナル増加の大きいシナプスを解析用に選択しましたが、すべてのブートンは20ヘルツ100の活動電位条件で検出可能な変化を示しましたが、高周波電気刺激では堅牢なフッ素応答が観察され、刺激中のエキソサイトーシスとその後の崩壊を示す蛍光変化は、エンドサイトーシスとシナプス小胞の再酸性化を反映しています。

蛍光減衰時定数は、刺激、強度、温度によって異なり、20ヘルツの25の活動電位は16.6秒、20ヘルツの100の活動電位は56.8秒、50ヘルツの500の活動電位は62.7秒で示されました。