定量的代謝フラックス研究のための洗浄済みヒト血小板の調製

私は、急性エストロゲン曝露が血小板中枢炭素代謝と安静時およびトロンビン活性化血小板に与える影響を研究しました。血小板への急性エストロゲン曝露が、経口避妊薬の使用によってもたらされる血栓性リスクの増加に寄与するかどうかを判断しようとしています。女性の健康研究は、主に資金不足です。

このプロジェクトは、女性の健康に関する知識のギャップに対処するためのNIHからのより大きな呼びかけの一部でした。避妊薬は50年以上前から利用可能ですが、血栓症のリスクを高める正確なメカニズムはまだわかっていません。生物学的変動性。

従来の細胞培養技術は血小板には適用されないため、血小板は異なる遺伝子型のドナーから供給されます。大きなサンプルサイズが必要であり、再現性のある血小板単離手順の必要性が強調されています。既存の血小板洗浄プロトコルは、血小板生物学の分野の専門家向けに作成されています。

血小板の研究には、私のプロトコルが初心者の血小板研究者のために強調している多くのユニークな課題があります。まず、ウォーターバスを摂氏37度に予熱し、グルコースを含む改変タイロード緩衝液をその中に置きます。すべてのバキュテナーから採取した全血を50ミリリットルのポリプロピレン製円錐管に結合します。

ベベルカットピペットチップを使用して、細胞数を計数するための適切な量のサンプルを採取します。ナローボアトランスファーピペットで慎重に吸引し、発生した気泡を取り除きます。次に、血液を摂氏37度の水浴で25分間休ませます。

遠心分離中の活性化を防ぐために、プロスタグランジンI2とアピラーゼを全血に加え、チューブを一度反転させてサンプルを混合します。次に、全血を250Gで15分間、摂氏37度で休憩せずに遠心分離します。バフィーコートと赤い血の層の上にある黄色の層として表示されるPRPを、壁に沿って新しい傾斜した50ミリリットルの円錐形のチューブに集めます。

PRPを摂氏37度で10分間休ませます。インキュベーション後、PRPを500ナノモルのプロスタグランジンI2およびアピラーゼ1ミリリットルあたり0.02単位と混合します。混合物を1, 000Gで摂氏37度で10分間遠心分離し、加速も休憩もしません。

次に、プラスチック製のワイドボアトランスファーピペットを使用して、上清をバルクボリュームで吸引し、次に先端がカットされていない1ミリリットルのピペットを使用して、ペレットの近くに残っている液体を吸引します。次に、プロスタグランジンI2とアピラーゼ含有タイロード緩衝液をペレットの円錐管の側面に加えます。ベベルカットチップと1ミリリットルのピペットチップを使用して、ペレットを数回静かに再懸濁します。

ペレットが再懸濁されたら、広口径のトランスファーピペットを使用して新しい円錐形チューブに移し、赤血球や目に見えて凝集した細胞を残します。次に、ベベルカットピペットチップを使用してフローサイトメトリー用のサンプルを採取します。残りの血小板を摂氏37度で1時間インキュベートして、阻害剤が摩耗するようにします。

インキュベーション後、サンプルを広口径ピペットで穏やかに混合し、サンプルを分注してフローサイトメトリーにかけます。全血からの平均血小板回収率は約52%で、洗浄プロセス後の白血球汚染は0.1%未満にとどまりました。P-セレクチン曝露は洗浄プロセス全体を通じて低かったが、トロンビン処理後に有意に増加した。

結合したフィブリノーゲンのレベルは最初の1、000Gの回転の後で最初に急上昇したが、トロンビンの処置の後で再度大幅に増加する第2回回転の後で5%以下に落ちた。血小板は、活性化マーカーを測定する前に、サイズ、シングレット、およびCD42a陽性についてうまくゲート化されました。トロンビン治療は、対照と比較してP-セレクチンおよびフィブリノーゲンの発現の有意な増加をもたらしました。

まず、ヒトの血液サンプルから洗浄した血小板を採取します。微量遠心分離機を摂氏0度に予冷した後、血小板懸濁液を部分的に凍結した生理食塩水に1:6の比率で回収します。混合物を16, 000Gで摂氏0度で10分間遠心分離します。

上清を別の微量遠心チューブに吸引します。次に、予め冷やしたメタノール0.5ミリリットルを加えます:マイナス20°Cの水で、急冷したペレットに1分間激しく渦巻きます。サンプルを液体窒素で凍結し、摂氏0度で解凍します。

懸濁液を16, 000Gで摂氏4度で10分間再度遠心分離し、新しい微量遠心チューブに上清を回収します。上清を一晩乾燥させた後、乾燥抽出物を150マイクロリットルのLC/MSグレードの水に再懸濁し、摂氏4度で15分間混合します。短時間ボルテックスし、抽出物を0.22マイクロメートルの微量遠心チューブに移して、細胞の破片を取り除きます。

サンプルを16, 000G、摂氏4度で5分間遠心分離します。遠心分離後、フィルターにさらに50マイクロリットルの水をピペットで移し、16,000Gおよび4°Cで5分間再度遠心分離します。最後に、分析のために濾液を収集します。

乳酸産生はすべてのドナーサンプルで陽性でしたが、グルコースとアセテートは一貫して消費され、トロンビンはこれらのフラックスを増強しました。