Name: 定量的代謝フラックス研究のための洗浄済みヒト血小板の調製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-10T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 6 s
Description: 学ぶ 洗浄済みヒト血小板の調製法と代謝フラックス測定法。エストロゲン曝露による血栓リスク増大メカニズムを解明し、女性の健康研究に貢献する再現性の高いプロトコルを確立します。

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この研究は、コロラド大学アンシュッツメディカルキャンパスから治験審査委員会の承認を受けました。書面による同意は、すべての研究参加者から得られました。参加者は、過去48時間にアルコールを摂取しなかった、または過去10日間に非ステロイド性抗炎症薬(NSAID)を摂取しなかったと報告しました。このプロジェクトは、国立衛生研究所の国立心臓・肺・血液研究所の賞番号R61HL141794でサポートされています。
1.採血
<ol>
	<li>採血の準備をします。採血は訓練を受けた瀉血専門医によって行われることをお勧めします。</li>
	<li>19Gの針を使用して、内側の腕に静脈穿刺を行います。</li>
	<li>最初の~2mLを無添加のバキュテイナーに集めて廃棄します。これは、血小板を活性化する可能性のある損傷した内皮細胞から化学シグナル伝達分子を除去するためです。最初の2mLを採取した後、止血帯を取り外して血小板のせん断応力を軽減します。</li>
	<li>残りの血液を抗凝固剤クエン酸デキストロース(ACD-A)バキュテーナーに14:3(血液:ACD-A)の比率で収集します。.採血後、各バキュテイナーを静かに反転させて、血液と抗凝固剤を混合します。</li>
</ol>
2.血小板洗浄
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67639/67639fig01.jpg"> 
図1:血小板洗浄に関与する連続的な遠心分離および再懸濁ステップ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67639/67639fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
注意: 気泡の発生は避けてください。トランスファーピペットを使用して、気泡が形成されたとき、特に遠心分離前に気泡を除去します。血液/血小板のチューブが開いている/閉じているたびに、キャップを閉じる前にチューブに息を吹き込んでCO2 レベルを上げることをお勧めします。
<ol>
	<li>遠心分離機を37°Cに予熱して、温度の影響を減らします。プロトコールの各遠心分離ステップ間で、遠心分離機を37°Cに維持します。</li>
	<li>ウォーターバスを37°Cに予熱します。 グルコースを含む改変タイロード緩衝液を水浴に入れます。 注:変更されたTyrodeのバッファーレシピは、 補足ファイル1にあります。</li>
	<li>すべてのバキューナーから採取した全血を50mLのポリプロピレンコニカルチューブに混ぜ合わせます。45°の角度でカットしたベベルカットピペットチップを使用して、適切な量のサンプルを採取し、細胞カウントを行います( 細胞カウントを参照)。</li>
	<li>細口径トランスファーピペットで慎重に吸引することにより、発生した気泡を取り除きます。</li>
	<li>血液を37°Cのウォーターバスで25分間休ませます これにより、可逆的に活性化された状態(体から取り出されたり、チューブからチューブに移されたりすることなど)の血小板が休息状態に戻ることができます。</li>
	<li>遠心分離中の活性化を防ぐため、500 nMのプロスタグランジンI2 (PGI2)と0.02 U/mLのアピラーゼを全血に加え、一度反転させて穏やかに混合します。 ナローボアトランスファーピペットを使用して、発生した気泡を取り除きます。 注:適切なPGI2 およびアピラーゼレシピの手順は、 補足ファイル1に記載されています。</li>
	<li>全血を遠心分離して多血小板血漿(PRP)を得ます(全血42 mLに対して250 x g で15分間)ブレーキなし(37°C)で。</li>
	<li>PRP(バフィーコートと赤血球層の上にある黄色の層)を、広口径トランスファーピペットを使用して新しい50mLコニカルチューブに静かに集めます。</li>
	<li>移すときは、きれいな円錐形のチューブを傾け、PRPをチューブの側面にそっと通します。気泡を避けてください。</li>
	<li>バフィーコート(PRPと赤血球の間の白血球の層)を乱さないように、約3mmのPRPを残してください。邪魔されると、トランスファーピペットに突然白い渦が巻かれたように見えます。</li>
	<li>細胞数を測定し( 血小板のカウントを参照)、次の洗浄ステップのための再懸濁量を決定します。</li>
	<li>37°Cで10分間休ませます。</li>
	<li>ベベルカットピペットチップを使用して、フローサイトメトリー用のサンプルを採取します( フローサイトメトリーを参照)。</li>
	<li>500 nM PGI2 と 0.02 U/mL のアピラーゼを PRP に加え、一度静かに反転させて混合します。</li>
	<li>1000 x g 、37°C(加速度:0、ブレーキ:0)で10分間遠心分離します。ブレーキは使用しないでください。ペレットはコンパクトではなく、急ブレーキがかかると再混合が発生する可能性があります。</li>
	<li>遠心分離中に、再懸濁量を決定します。75% の回復を想定します。細胞密度を約3x105 細胞/μLとします。</li>
	<li>バルク容量にはプラスチック製のワイドボアトランスファーピペットを使用し、ペレットの近くの残りの液体には1mLピペット(カットされていない先端)を使用して上清を吸引します。チューブの底にあるペレットには触れないでください。</li>
	<li>500 nM PGI2 と 0.02 U/mL のアピラーゼを修飾 Tyrode バッファーに添加します。ステップ16で計算した量のバッファーを、円錐形チューブの側面に滴り落ちてゆっくりと加えます。</li>
	<li>ベベルカットチップと1mLピペットチップを使用して、数回ピペッティングで優しく上下させることで、ペレットを穏やかに再懸濁します。<ol>
		<li>容量を300μLに設定し、液体ラインより上でプランジャーを完全に押し下げてから、ピペットを液体の下に置き、最初のストップまで来てください。これにより、科学者は、血小板を活性化する可能性のある気泡を誤って生成することなく、ペレットを再懸濁することができます。</li>
		<li>時折、ペレットの底に目に見える赤血球の輪があります。これを再一時停止しないでください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ペレットが再懸濁されたら、広口径のトランスファーピペットを使用して、再懸濁したペレットを新しい円錐形のチューブに移し、赤血球や目に見えて凝集した細胞を残します。</li>
	<li>手順 11 から 20 を繰り返します。新鮮なアリコートから500 nM PGI2 と0.02 U/mLを改変Tyrodeバッファーに必ず追加してください(ステップ18の改変Tyrode'sバッファーは再利用しないでください、PGI2 は不安定すぎます)。</li>
	<li>セルカウントのサンプルを採取します。必要に応じて、改変されたタイロード緩衝液で血小板濃度を調整します。.</li>
	<li>ベベルカットピペットチップを使用して、フローサイトメトリー用のサンプルを採取します。</li>
	<li>血小板を37°Cで1時間休ませて、阻害剤が消耗する時間を確保し、可逆的に活性化された血小板が休止状態に戻るのを待ちます。</li>
	<li>ワイドボアピペットでやさしく混ぜます。フローサイトメトリー用のサンプルを採取します。</li>
	<li>洗浄された休止血小板は、代謝分析に使用する準備が整いました。</li>
</ol>
3. 血小板のカウント
<ol>
	<li>血小板は、自動血球カウンター(製造元の指示に従ってください)または血球計算盤33のいずれかを使用してカウントできます。</li>
</ol>
4. フローサイトメトリー
<ol>
	<li>準備<ol>
		<li>抗体ミックスのセットアップと血小板活性化を測定するためのフローサイトメーターの準備に関する詳細なプロトコルとベストプラクティスのレビューは、他の場所で見つけることができます34,35。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>サンプリング<ol>
		<li>フローサイトメトリー用のサンプルを採取する場合は、ベベルカットピペットチップを使用して血小板懸濁液を採取します。これを抗体を入れた微量遠心チューブにゆっくりと加え、軽くフリックして混合します。30秒間インキュベートします。</li>
		<li>ベベルカットピペットチップを使用して、血小板懸濁液/抗体混合物を96ウェルプレート上の適切なウェルに移します。</li>
		<li>すぐにウェルに固定剤を添加して細胞を固定します。</li>
		<li>固定後8時間以内にフローサイトメーターで測定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>アゴニスト感度試験<ol>
		<li>洗浄後、15 mLコニカルチューブ2本(1本は安静時コントロール用、もう1本はトロンビン活性化コントロール用)を取っておきます。</li>
		<li>ベベルカットピペットチップを使用して、100 μLの血小板懸濁液を各円錐チューブに静かにピペットで固定します。37°Cで1時間休ませます。</li>
		<li>1時間の休息後、0.1 U / mLのトロンビンを1つのチューブに追加し(トロンビンの準備手順は 補足ファイル1に記載されています)、もう1つのチューブにビヒクルを追加します。.37°Cで15分間インキュベートします。</li>
		<li>各チューブのフローサイトメトリーサンプルを採取して、アゴニストに対する血小板の感受性を測定します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. 定量的代謝フラックス分析のためのサンプリング
<ol>
	<li>焼 入 注:代謝の消光は、正確な代謝フラックスを測定するために必要なステップです。細胞を急速に冷却し、その温度を4°C以下に維持すると、代謝が十分に遅くなり、サンプリングされた細胞がバルクからの細胞の代謝を正確に反映するように、代謝が本質的に停止したと想定できます。使用できる方法はさまざまですが、急速冷却の必要性と漏れの最小化のバランスをとるには、冷塩水(-4°C)の生理食塩水36を使用してください。塩がその後の分析を妨げる場合は、別の流体(メタノール/水、エタノールなど)を使用できます37.<ol>
		<li>生理食塩水のアリコートを準備して凍結します。各生理食塩水アリコートを目的のサンプルの6倍の量にします。 注:通常の生理食塩水レシピは 、補足ファイル1にあります。</li>
		<li>微量遠心分離機を0°Cに予冷します。</li>
		<li>部分的に凍結した生理食塩水(&lt;-4°C)に血小板懸濁液を1:6の比率で回収します(例、微量遠心チューブで150μLの血小板懸濁液を750μLの生理食塩水に回収します)。 注:血小板/生理食塩水を氷の上に15分以上放置しないでください。</li>
		<li>16,000 x g、0°Cで10分間遠心分離します。</li>
		<li>上清は外部代謝物分析用に保存し、ペレットは細胞内代謝物の抽出と測定用に保存します。分析の準備が整うまで、両方を-20°Cで保存してください。</li>
		<li>このプロセスを、目的の時間間隔とサンプル時間ポイントの数にわたって繰り返します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>細胞内代謝物抽出<ol>
		<li>0.5 mLの予め冷却した7:3メタノール水(-20°C)を急冷したペレットに加えます。1分間激しく渦巻きます。</li>
		<li>液体窒素で凍結し、0°Cで解凍し、さらに2サイクル繰り返します。</li>
		<li>懸濁液を16,000 x g で-4°Cで10分間遠心分離します。</li>
		<li>上清を新しい微量遠心チューブに集めます。</li>
		<li>ステップ3のペレットを使用し、50:50メタノール:水で抽出プロトコル(ステップ1〜3)を繰り返します。2 番目に収集した抽出を 1 番目の抽出物に追加します。一晩乾燥させます。</li>
		<li>乾燥抽出物を150 μLのLC-MSグレードの水(または目的の分析に適した他の溶解剤)に再懸濁します。4°Cで15分間混合します。 短時間ボルテックスし、0.22 μmの微量遠心チューブに移して細胞の破片を取り除きます。16,000 x g 、4°Cで5分間遠心分離します。</li>
		<li>遠心分離機から取り出し、さらに50 μLのオプティマ水をフィルターにピペットで移し、再度遠心分離(5分、16,000 x g 、4°C)してフィルターをすすぎます。分析のために収集します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>代謝研究のための静止血小板の単離

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上M フィルター スピンX チューブ</td><td>ミラポア シグマ</td><td>CLS8160</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>19 G x 3/4" ニードル</td><td>McKesson Corporation</td><td>448406</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>21 G 1.5 インチ ニードル ルアーロック付き</td><td>Amazon</td><td>B0C39PJD23</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>96 ウェルプレート、ハーフエリア</td><td>Greiner Bio-One</td><td>675101</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>ACD-A vaccutainers&nbsp;</td><td>フィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>364606</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>アダプター</td><td>マッケソンコーポレーション</td><td>609</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>アルコール綿棒</td><td>VWR</td><td>15648-916</td> ジャガイモからの<td>瀉血</td></tr><tr>ア<td>ピラーゼ</td><td>シグマ</td><td>A6410-100UN</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>CD42a モノクローナル抗体</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>48-0428-42</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>チルドマイクロ遠心分離機&nbsp;</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック <td>75002441</td>ク<td>エンチング</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>FITC 抗フィブリノーゲン抗体</td><td>アブカム</td><td>4217</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>フローサイトメーター ベ</td><td>ックマン・コールター</td><td>82922828</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>ガーゼ</td><td>VWR</td><td>76049-110</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>Sigma アルドリッチ</td><td>G5516</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>ヒトα-トロンビン</td><td>Prolytix</td><td>HCT-0020</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>微量遠心チューブ</td><td>VWR</td><td>87003-292</td><td>一般</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>ナローボアトランスファーピペット</td><td>VWR</td><td>16001-176</td><td>血小板洗浄</td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド溶液、PBS中の4%</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281692</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>PECy5 マウス 抗ヒト CD62P</td><td>BD Pharmingen</td><td>551142</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>プレートカバー</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>AB0626</td><td>フローサイトメトリー</td></tr><tr><td>ポリプロピレン 15 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>ポリプロピレン 50 mL コニカルチューブ</td><td>VWR</td><td>352070</td><td>血小板洗浄</td></tr><tr><td>プロスタグランジン I2 (ナトリウム塩)</td> <td>ケイマン化学</td><td>18220</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>SKC Inc. Cチップ 使い捨て血球計算盤</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>22-600-100</td><td>細胞計数</td></tr><tr><td>シリンジ</td><td>BD Pharmingen</td><td>14-823-41</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>止血</td>帯 <td>VWR</td><td>76235-371</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>血管ニードルホルダー</td><td>BD</td><td>364815</td><td>瀉血</td></tr><tr><td>ボルテクサー</td><td>VWR</td><td>102091-234</td><td>試薬調製</td></tr><tr><td>ウォーターバス</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>TSGP02</td><td>血小板洗浄</td></tr><tr><td>広口径トランスファーピペット</td><td>VWR</td><td>76285-362</td><td>血小板洗浄</td></tr></tbody></table>

定量的代謝フラックス研究のための洗浄済みヒト血小板の調製

Preparation of Washed Human Platelets for Quantitative Metabolic Flux Studies

図 2 の代表的な結果は、3 人の男性と 3 人の女性を含む 6 人の異なる献血者を表しています。全血に対する血小板収量を図2Aに示します。最終的な血小板回復率は平均52%±3%でした(標準偏差、n = 6)。最終血小板数と白血球の汚染を比較し、自動血液分析装置を用いて測定しました。白血球数は全細胞の0.1%未満でした(図2B)。洗浄プロセスと1時間の休息を通じて、血小板は低いP-セレクチン曝露を維持しましたが、トロンビン治療には強く反応しました(図2C)。結合したフィブリノーゲンは、最初の1000 x gスピン後に急上昇しますが、2回目の1000 x gスピン後には5%未満に戻ります。P-セレクチン曝露と同様に、結合したフィブリノーゲンは、1時間の安静後のトロンビン処理後に劇的に増加します(図2D)。サイ...

Platelets are blood cells that play an integral role in hemostasis and the innate immune response. Platelet hyper- and hypoactivity have been implicated ...

preparation-washed-human-platelets-for-quantitative-metabolic-flux

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このビデオでは、巨核球の分化と血小板の形成の技術を示しています。造血幹細胞(ヒト臍帯血から単離)は、トロンボポエチンの存在下で成熟した巨核球に分化します。成熟した巨核球は、プロプレートレットと呼ばれる細胞質の伸長を産生し、個々の血小板を生じさせます。...

巨核球と血小板形成の分化のためのIn Vitro法

このビデオは、前処理され、洗浄されたヒト血小板におけるコラーゲン誘発血小板凝集を評価するための比濁分析を示しています。対照ウェルはコラーゲン誘導性凝集を示しますが、高濃度の阻害剤はパネキシン-1チャネルをブロックし、それによってコラーゲン誘発性血小板凝集を阻害します。これは、変化しない濁度から明らかです。...

前処理されたヒト血小板のコラーゲン誘発凝集をモニターするための比濁分析

血液白血球および血小板は、個体の全体的な生体エネルギー健康のマーカーとして使用されるので、病理学的プロセスと治療の影響を監視する可能性を有することができる。ここでは、ミトコンドリアの機能と、これらの細胞における酸化的バーストを分離し、測定する方法を記載している。...

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

ここでは、単離されたヒト血小板は私がロテノンを阻害複雑に応じて代謝適応を研究するためにアクセス可能なex vivoでのモデルとして使用できることを示します。このアプローチは、液体クロマトグラフィー - 質量分析法によって同位体トレースおよび相対的定量化を使用し、研究デザインの多様に適用することができます。...

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

我々は、比濁法によるアゴニスト誘導性血小板凝集の測定に続いてヒト血液からの洗浄した血小板を単離するための簡単な方法を記載します。一例として、我々は、ブリリアントブルーFCF Pannexin1チャネル阻害剤とのプレインキュベーション後にコラーゲンをヒト血小板の凝集応答を研究するため、この方法を適用します。...

コラーゲン誘発凝集に対するPannexin1阻害剤の効果ブリリアントブルーFCF：比濁法は、人間に洗浄血小板を

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。...

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー...

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。...

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

ここでは、抗凝固剤の存在下でマウス血液を採取した。血小板は、低速遠心分離を用いてイオヘキソール勾配培地によって精製した。血小板は、実行可能であるかどうかを調査するためにトロンビンで活性化された.精製された血小板の質を、フローサイトメトリーおよび顕微鏡検査によって分析した。...

マウスの血液からの血小板の浄化

凝固促進剤の血小板形成は、血栓症のリスク増加と相関しています。.ここに提示されるのは、ヒトの血液から洗浄された血小板を単離するための正確なプロトコルであり、凝固促進剤の血小板の特徴であるホスファチジルセリンおよび微小胞放出の曝露を定量化することを目的としています。...

ヒト精製血小板からのホスファチジルセリン曝露と微小胞放出の測定による凝固促進血小板の特性評価

ここでは、骨髄、脾臓、梗塞性心筋からマクロファージを抽出し、その後、生細胞の代謝フラックスを評価する方法を詳しく紹介します。...

脾臓および心臓マクロファージおよび骨髄単球における ex vivo 代謝フラックスの解析

学ぶ 洗浄済みヒト血小板の調製法と代謝フラックス測定法。エストロゲン曝露による血栓リスク増大メカニズムを解明し、女性の健康研究に貢献する再現性の高いプロトコルを確立します。

定量的代謝フラックス研究のための洗浄済みヒト血小板の調製

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