反復磁気刺激下 でのin vitro でのミエリン破片のミクログリア食作用の評価

[講師]私たちの研究の範囲は、神経リハビリテーションと磁気シミュレーション療法の研究に焦点を当てています。このプロトコルは、磁気刺激が明確な機能にどのように影響するかを探る上で、磁気刺激の新しいアイデアを提供することができます。今後は神経リハビリテーションや磁気刺激療法にも力を入れていきます。

[講師]まず、メスのネズミの首を切られた頭を入手します。氷の上で頭を解剖します。はさみで頭蓋骨を二等分して脳を完全に露出させ、完全に除去できるようにします。はさみと鉗子を使用して、膜、小脳、海馬を細心の注意を払って無菌的に切除します。PBSで脳を3回洗浄し、残留血液や組織を除去します。洗浄した脳を10ミリリットルの0.32モル滅菌スクロース溶液に移します。顕微手術用ハサミで、脳組織を細かく切り、脳組織とスクロースの混合物を取得します。次に、脳組織とスクロースの混合物を50ミリリットルの滅菌ホモジナイザーに移します。30ミリリットルの0.32モル滅菌スクロース溶液を加えます。50ミリリットルのガラスホモジナイザーを使用して、組織を2分間粉砕します。滑らかな脳組織ホモジネートを得るため。脳組織ホモジネートを0.32モルの滅菌スクロース溶液で90ミリリットルに希釈し、完全に混合します。20ミリリットルの0.83モル滅菌スクロース溶液を6本の滅菌薄肉ポリプロピレン超遠心チューブに加えます。次に、15ミリリットルの脳混合物をチューブの上部にゆっくりと分配します。0.32モルの滅菌スクロース溶液で容量を平らにします。粗ミエリンの破片を収集するには、まず摂氏4度で予冷し、超遠心分離ローターを使用します。サンプルを75,000 Gで45分間遠心分離し、滅菌牧草ピペットを使用して2つのスクロース密度の間の界面からミエリン破片を収集します。最初の等張分離と精製では、収集したミエリン破片溶液を50ミリリットルの遠心分離管に移します。予冷した滅菌PBSで容量を35ミリリットルに調整し、新しいホモジナイザーチューブに移します。3分間均質化した後、ミエリン破片ホモジネートを6本の38.5ミリリットル滅菌薄肉ポリプロピレン超遠心チューブに均等に分配します。滅菌PBSで体積を補い、遠心分離します。2回目の等張分離および精製では、固体の白色ペレットを10ミリリットルの予冷滅菌PBSに再懸濁して、ミエリン破片懸濁液を得る。懸濁液を以前と同様に超遠心チューブに分配し、遠心分離します。遠心分離後、上清を廃棄します。固体の白色ペレットを6ミリリットルの滅菌PBSに再懸濁します。ミエリン破片懸濁液を6本の1.5遠心分離管に分け、再度遠心分離します。最後に、上清を廃棄した後、ペレットを100マイクロリットルの予冷滅菌PBSに再懸濁します。必要なミエリンの破片を摂氏4度または氷水で解凍し、以前と同様に10分間遠心分離します。ミエリン破片を200マイクロリットルの50マイクロモルCFSE溶液に再懸濁します。懸濁液を室温で暗所で30分間インキュベートし、再度遠心分離します。上清を廃棄し、サンプルを500マイクロリットルの滅菌PBSで3回洗浄します。ミエリン破片を100マイクロリットルの予冷滅菌PBSに再懸濁して、蛍光標識ミエリン破片の懸濁液を得る。さらに使用するまで、サンプルは摂氏-80度で保管してください。in vitro反復磁気刺激の場合は、治療周波数を20ヘルツ、治療強度を最大出力強度の1%、刺激時間を5秒に設定します。20 秒の休憩時間を含め、2.5 分の 1 回の治療時間で 600 パルスを投与します。磁気刺激パラメータを事前に決定した後、コイルの方向を地面に対して垂直に固定し、上向きにします。磁気刺激コイルをアルコールで滅菌し、細胞汚染を防ぎます。50マイクロモルのCFSEを加えた後、1,000個のBV-2細胞を24ウェルプレートに一晩プレーティングし、ピペットで古い培地を吸引し、すぐに新鮮な無血清培地を加えます。培地を無血清培地に変更し、1ミリリットルリポ多糖類あたり1マイクログラムで細胞を12時間処理します。 リポ多糖類介入を12時間行った後、ミエリン破片1ミリリットルあたり100マイクログラムを培地に加え、暗所で共培養します。前に示したように、細胞に繰り返し磁気刺激を与えます。プレートにアルコールをスプレーして滅菌してから、インキュベーターに戻します。ミエリン断片との共培養期間の後、吸収されていないミエリン破片をPBSで穏やかに洗浄します。細胞を4%パラホルムアルデヒドで15分間固定します。次に、10%ロバ血清アルブミンと0.3%Triton X-100を含む150マイクロリットルのPBSをウェルに加え、インキュベートします。ウェルをPBSで洗浄した後、一次抗体溶液を100〜200の比率でウェルに加え、低温でインキュベートします。次に、二次抗体中の細胞を室温で100〜300の比率で2時間インキュベートしてから、共焦点顕微鏡でイメージングします。BV-2ミクログリア細胞は、リポ多糖類処理後にミエリン破片の食作用の有意な減少を示しました。これは、磁気刺激介入を繰り返すと逆転しました。定量分析により、対照と比較してリポ多糖類群の BV-2 細胞内のミエリン破片面積が大幅に減少し、リポ多糖類で処理された磁気刺激群では顕著な増加が確認されました。ミエリン破片と共局在するIBA-1陽性ミクログリアの割合は、対照と比較してLPS群で有意に低かったが、磁気刺激はこの割合を有意に増加させた。ミクログリアの食作用の時間依存的な増加が観察され、私たちのグループのリポ多糖類で処理された磁気刺激群では、ミエリン破片の取り込みが有意に高いことが示されました。