マウス内耳組織の凍結切片および免疫染色:胚期から成虫期まで

私の研究は蝸牛の神経発達に焦点を当てています。具体的には、蝸牛内でのSNAPS形成の根本的なメカニズムを明らかにし、アルツハイマー病と難聴の関連性を調査することを目指しています。ライブイメージングと遺伝ツールは、蝸牛構造と神経回路をより詳細に研究する能力を向上させ、監査システムの回復力と機能不全についてより深い洞察を提供します。このプロトコルを公開することで、オーディター科学に不慣れな研究者、特にこれまで蝸牛を扱ったことのない研究者を支援したいと考えています。このガイドでは、胚、新生児、成体マウスから内耳サンプルを調製する方法を段階的に説明します。私たちの目的は、内耳の実験を容易にし、結果の信頼性と一貫性を確保することです。断面免疫染色には、ホールマウント免疫染色などの他の方法に比べていくつかの利点があります。タンパク質と核酸をよく保存し、薄いほぼ2Dの切片を作成するため、測定がより正確で一貫性があります。また、この方法により、すべての蝸牛細胞タイプが無傷で目に見える状態に保たれ、免疫染色のカルトが向上します。ホールマウント製剤とは異なり、断面はらせん靭帯、血管線条、ライスナー膜、蓋膜などの重要な構造を保存します。

[講師]まず、安楽死させた若年マウスを手術台に置きます。細い解剖はさみを使用して、首から鼻に向かって頭皮に沿って正中線を慎重に切開します。次に、はさみの下の刃を大孔に、上の刃を頭蓋骨に置きます。頭蓋骨の上半分を鼻まで切り、2番目の切り口を完了します。部分的に切り開いた頭からハサミを元に戻します。はさみの下の刃を頭蓋骨の下部に置き、上の刃を大孔に置きます。頭の下半分を鼻までカットして、3番目のカットを完了します。細い鉗子とはさみを使用して、脳、筋肉、結合組織など、側頭骨を取り巻く軟部組織を慎重に切り離します。次に、マウスのハーフヘッドをPBSを含む24ウェルプレートのウェルに入れます。PBSを固定用の4%パラホルムアルデヒド溶液に置き換え、室温で45分間インキュベートします。固定後、PBSで組織を5〜10分間3回すすぎます。マウスの半分の頭の中に側頭骨または内耳包を見つけます。細い鉗子を使用して、内耳嚢を取り巻く軟部組織を慎重に切り離します。緩めたら、内耳嚢の周りの組織を切断します。次に、鉗子を使用して内耳包の周囲の領域に穏やかな圧力を加え、完全に解放します。内耳サンプルを摂氏4度のPBSに保存します。まず、成体の安楽死マウスを手術台に置きます。鋭利な解剖はさみを使用して、首から鼻に向かって頭皮に沿って正中線を切開します。最初のカットで皮膚を折り返して頭蓋骨を露出させます。はさみの下の刃を大孔に置き、上の刃を頭蓋骨に置きます。頭蓋骨の上半分を鼻まで切り、2番目の切り口を完了します。部分的に切り開いた頭からハサミを元に戻します。下部のブレードを頭蓋基部に配置し、上部のブレードを大孔に配置します。内耳を避けて、頭の下半分を正中線に沿って鼻まで切ります。各半頭について、鉗子とハサミを使用して、脳、筋肉、結合組織など、側頭骨を取り巻く軟部組織を剥がします。次に、頭蓋骨組織を指で逆にカールさせ、親指を使って側頭骨の下側に穏やかな圧力をかけます。周囲の付着物から骨を徐々に緩めます。内耳カプセルを取り外したら、PBSでよくすすいでください。4%パラホルムアルデヒドで満たされたシルガード皿を顕微鏡下に置きます。皿に単一の内耳カプセルを配置します。内耳に付着した軟部組織や骨がないか調べ、そっと取り除きます。楕円形の窓を特定し、鉗子を使用してあぶみ骨をそっと取り除きます。次に、細い鉗子を使用して、蝸牛の頂点に小さな穴を開きます。4% パラホルムアルデヒドを充填した P20 ピペットを使用して蝸牛を洗い流し、希釈した血液や内リンパなどの液体が楕円形の窓から排出されるようにします。固定蝸牛を4%パラホルムアルデヒドで満たされた24ウェルプレートに移します。時間に印を付け、ロッカーまたは章動装置を使用して穏やかに攪拌しながら30〜60分間インキュベートします。インキュベーション後、サンプルをPBSで5〜10分間3回すすぎます。最後のすすぎの後、蝸牛を1.25ミリモルのEDTAに入れ、摂氏4度で2〜3日間揺らします。EDTA処理後、蝸牛をPBSで5分間3回すすぎます。まず、解剖した内耳カプセルを10%スクロース溶液に入れ、室温で2時間インキュベートします。インキュベーション後、10%スクロース溶液を20%スクロースに交換し、さらに2時間インキュベートします。次に、20%スクロース溶液を30%スクロースに置き換え、サンプルを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、30%ショ糖溶液の半分を取り除きます。最適な切断温度またはOCTコンパウンドでスペースを埋め、サンプルを30分から2時間揺らします。 サンプルをOCTコンパウンドで満たされた標識クライオモールドに移します。埋め込まれたクライオブロック内の蝸牛の向きを確認します。内耳を確保します。の凹面は、標準的な人工内耳断面のクライオモールドの狭い側面に面しています。次に、ドライアイスを小さな容器に入れ、5〜10ミリリットルのジメチルブタンを加えます。OCTを含むクライオモールドとサンプルを泡立つドライアイスの上に置き、ブロックを急速に凍結します。クライオブロックを摂氏マイナス20度に事前に冷却されたクライオスタットのチャンバーに移します。サンプルを30〜60分間平衡化させます。鉛筆またはペンを使用して、蝸牛の位置に対応するクライオブロックの側面に印を付け、切片の適切な向きを確認します。次に、OCT の小さなプールをチャックに追加し、その上にクライオ ブロックを置き、鉛筆の跡のない広い面が下を向くようにします。OCT とサンプルを含むチャックを冷却したクライオスタット チャンバーに入れ、OCT を完全に凍結させます。数分後、サンプルの入ったチャックをチャックホルダーに置き、鉛筆のマークを右または左に向けます。クライオスタットで、組織が明らかになるまで40マイクロメートルの設定を使用してブロックをトリミングします。組織が明らかになったら、凍結切片用に設計されたスライドを使用して12マイクロメートルの切片を採取します。顕微鏡で切片位置を確認します。蝸牛ターンに近づく場合は、12マイクロメートルの切片の採取を続け、すべての蝸牛ターンが切断されるまで定期的に位置をチェックします。