マウス肺からの生きた骨髄系および上皮細胞集団の単離

ウイルス感染後の肺の修復について研究しています。私たちは、免疫細胞が上皮修復を媒介するメカニズムと、ウイルス損傷後のリモデリングとその後の修復が将来の疾患病理にどのように影響するかを理解することを目指しています。このプロトコルは、上皮細胞と間質細胞、または免疫細胞のいずれかに最適化された肺消化物の非互換性に対処します。

私たちの研究では、免疫コンパートメントと非免疫コンパートメントの両方から生存細胞を分離する必要があります。さらに、上皮およびマクロファージサブセットのゲーティング戦略を提唱し、これがこの分野に利益をもたらすことを願っています。当研究室では、気道内の免疫細胞と上皮細胞との間の定常状態下でのクロストークと、環境課題への対応について研究しています。

私たちの最終的な目標は、組織の修復を強化し、病気の発症を防ぐために、このコミュニケーションを調節する最善の方法を決定することです。まず、マウスに70%エタノールをスプレーします。細い手術用ハサミと7番の鉗子を使用して、腹部を切開し、腹膜を横方向に切ります。

ダイヤフラムに小さな切り込みを入れて、真空を逃がします。次に、横隔膜と下部胸郭を体腔から切り取り、肺と心臓を露出させます。27ゲージの針を取り付けた10ミリリットルの注射器を使用して、DPBSで5ミリリットルの2ミリモルEDTAを肺に灌流します。

胸骨を縦に切り込み、側面に沿って切り込みを入れて胸郭を開き、気管を露出させます。細いハサミと7番の鉗子を使用して、気管や肺に穴を開けることなく、できるだけ多くの筋肉と結合組織を取り除きます。次に、気管を2/0縫合糸で包み、結ぶように配置しますが、締め付けないでください。

気管に横方向の切り傷を付け、カテーテルを挿入します。次に、縫合糸をしっかりと引っ張ってカテーテルを所定の位置に固定します。注射器を使用して、1ミリリットルのDPBSで肺を膨らませます。

次に、シリンジをゆっくりと引き戻してDPBSを引き出します。同じDPBSで肺を再膨らませ、再度シリンジを引き戻して気管支肺胞洗浄液(BAL)を収集します。

収集したバルブをマイクロ遠心チューブに分注します。次に、同じ1ミリリットルの注射器に1ミリリットルのディスパーゼを入れます。シリンジをカテーテルに取り付け、ディスパーゼで肺を膨らませます。

カテーテルを抜くときは、気管の周りの縫合糸を締めて、ディパスの漏れを防ぎます。はさみを使用して、気管を横方向に切ります。肺と気管を上に引っ張りながら、胸郭の背面に沿って結合組織を切り裂くことにより、体腔から肺を取り出します。

次に、肺から心臓を取り出します。氷上の5ミリリットルのDPBSに肺を置きます。400 Gで4°Cで5分間遠心分離バルブ。

ピペットで上清を吸引し、ペレットを100マイクロリットルのRPMIに再懸濁します。まず、マウスから採取した肺の5つの葉を解剖し、結合組織を廃棄します。解剖した肺組織をスライドガラスの上でハサミで1分間切り刻みます。

解剖ハサミを使用して、刻んだ肺組織を50ミリリットルの遠心分離管に移します。次に、3ミリリットルの消化液を加え、肺消化液を上下に2〜3回ピペットで動かします。最後に、BALから回収した細胞ペレットをRPMIに再懸濁します。

チューブを45度の角度で、摂氏37度で140RPMに設定されたオービタルシェーカーに40分間置きます。インキュベーション後、チューブをシェーカーから取り出し、氷の上に置きます。肺消化混合物を5〜6回上下にピペットで動かします。

混合物を70マイクロメートルのセルストレーナーでろ過し、新しい50ミリリットルのチューブに入れます。残りの細胞をフィルターで洗浄し、RPMI培地中の5%FBSの10ミリリットルで酵素を中和します。サンプルを600Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。

真空吸引器を使用して上清を吸引します。細胞ペレットを1ミリリットルのACK溶解バッファーに再懸濁し、室温で3分間インキュベートして赤血球を溶解します。次に、9ミリリットルのPBSを加え、ピペットで上下に動かして溶液を混合します。

再度、サンプルを遠心分離し、真空吸引器を使用して上清を除去し、細胞ペレットを1ミリリットルの蛍光活性化細胞選別緩衝液に再懸濁します。懸濁液を64マイクロメートルメッシュでろ過し、フローサイトメトリー分析用のマイクロ遠心チューブに入れます。