Name: 天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: 学ぶ ブタ腸管オルガノイドを用いた二次元単層培養法。TEER測定とUssingチャンバー実験で、生体内輸送特性を再現するモデルを構築し、従来の動物実験に代わる消化管生理学研究の新たな手法を確立する。

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このプロトコルでは、2匹の健康なブタ(ベントハイムブラックパイドブタ、雄1匹、雌1匹、生後4.5ヶ月、約65kg)が捕獲されたボルトシュートと出血によって犠牲にされました。動物愛護法では、これ(屠殺及び組織の除去)は動物実験に該当せず、動物福祉担当官(登録番号)に告知する必要があります。TiHo-T-2023-15) ハノーバー獣医大学財団の
1.インサートのコーティング
注:すべてのステップは、安全キャビネットの下で滅菌材料を使用して実行されます。プロトコルのすべてのステップは、特に明記されていない限り、氷上で実行されます。
<ol>
	<li>凍結した基底膜を氷上で室温で少なくとも1時間、または氷の上で4°Cで一晩解凍します。 基底膜を1:40(v / v)と氷冷滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を円錐形のチューブで混合します。</li>
	<li>インサート付きの滅菌プレートをパッケージから取り出します。200 μLの基底膜ミックスを各インサートの頂端コンパートメントに加えます。</li>
	<li>ウェルプレートの蓋を元に戻し、インキュベーター内で37°C、5%CO2 で少なくとも1.5時間インキュベートします。</li>
	<li>細胞を播種する前に、溶液を慎重に吸引してください。吸引中に先端がメンブレンに触れないようにしてください。</li>
</ol>
2. 2次元オルガノイド単分子膜の生成
注:ブタ結腸オルガノイドは、ブタ空腸オルガノイド25について記載されたように生成および培養されます。3Dオルガノイドの生成後、これらは少なくとも3〜4週間培養し、一貫した成長を確保するために毎週の継代を行う必要があります。3Dオルガノイドを含む各ドーム内の細胞の数は、後続のステップで溶解されるため、1つの膜貫通フィルターをカバーするのに十分です。単分子膜を作製する前に、3Dオルガノイドを光学的品質管理にかけ、以前の成長と汚染の可能性を確認しました(図1)。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig01.jpg"> 
図1:代表的な3Dオルガノイド。 三次元の(A)空腸オルガノイドと(B)結腸オルガノイドは、単層を生成する前に顕微鏡で慎重に検査されます。以前の成長パターン、構造的完全性、不純物や汚染の存在を評価することに特別な注意が払われています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<ol>
	<li>オルガノイド培地(表1)を3D陰窩オルガノイドでウェルから取り出します。ウェルあたり1 mLの氷冷PBSを加え、p1000チップでピペッティングして基底膜を穏やかに溶解します。</li>
	<li>溶解したすべてのオルガノイドを、10 mLの氷冷PBSをあらかじめ充填した15 mLのチューブに集めます。チューブを250 x gで4°Cで10分間遠心分離します。 上清を吸引します。</li>
	<li>ペレットを1 mLの温かい(37°C)0.05%(v / v)トリプシン/ EDTAに再懸濁します(この段階で2本のチューブをプールできます)。ウォーターバスで37°Cで5分間インキュベートし、その後直接氷の上に置いて反応を停止します。</li>
	<li>p1000チップで20倍、p1000チップ+p200チップを上にしてさらに15倍氷上に再懸濁します。10%(v / v)のウシ胎児血清(FCS)を添加した氷冷DMEM10mLを加えます。</li>
	<li>1,000 x gでチューブを遠心分離し、4°Cで10分間。 上清を捨て、ペレットを1 mLの単層培地に再懸濁します(表1)。</li>
	<li>製造元の指示に従って、ノイバウアーチャンバーを使用してmLあたりの生細胞数を決定します。</li>
	<li>この時点でコーティング溶液を頂端コンパートメントから取り出し、500μLの温かい(37°C)単層培地と交換します。3 mLの単層培地を基底外側コンパートメントに加えます。.</li>
	<li>各空のトランズウェルインサートのブランク抵抗(TEER)を決定します(ステップ3で詳しく説明します)。細胞が乾燥するのを防ぐために、頂端チャンバー内に培地が存在しない時間はできるだけ短くする必要があります。</li>
	<li>頂端単層培地を取り出し、空腸2D培養用に2 x 105 上皮細胞を、結腸2D培養用に1.5 x 105 上皮細胞を各トランズウェルの頂端チャンバー内の500 μLの単層培地に加えます。</li>
	<li>培地を交換し、2〜3日ごとにTEERを測定します。媒体を交換する前にTEERを測定してください。頂端コンパートメントと基底コンパートメントの培地を慎重に吸引し、500 μLまたは3 mLの新鮮で温かい(37°C)培地と交換します。<ol>
		<li>空腸オルガノイドの場合:16日目に播種後、単層培地から分化培地に変更します(表1)。結腸オルガノイドの場合:7日目に培地を分化培地に変更します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>分化媒体を毎日交換し、媒体交換のたびにTEER測定を行います。18日目(空腸オルガノイドの場合)または9日目(結腸オルガノイドの場合)に、播種後、機能実験を進めます。</li>
</ol>
3. 経上皮電気抵抗(TEER)の測定
注意: すべての測定は、汚染を避けるために安全キャビネットの下で行われます。細胞を播種する前に、すべての空のコーティングされたトランズウェルを測定して、個々のブランク値を取得します。ボルトオームメーターは、導入されたUSBデバイスに値を保存します。
<ol>
	<li>箸の電極を70%(v / v)エタノールで洗浄し、電極を完全に乾かします。その間、プレートをインキュベーターから取り外し、キャビネットの下に置きます。</li>
	<li>箸電極の短いアームをインサートの頂端コンパートメントに、長いアームをインサートの基底外側コンパートメントに導入します。短いアームが細胞層に接触しないようにしてください。</li>
	<li>各トランズウェルの経上皮電気抵抗を測定します。ボルトオーム計を平衡化させて、安定した測定を確保します。TEER 値を測定するには、[ストア] ボタンをクリックします。</li>
	<li>残りのウェルでステップ 3.2 と 3.3 を続けます。最後の井戸に到達すると、ボルトオームメーターはデータをUSBデバイスに保存するためのリクエストを開きます。 「保存」をクリックします。</li>
	<li>各プレートの後と測定の最後に電極を清掃し、完全に乾かしてから保管してください。</li>
	<li>測定された細胞値から、細胞を播種する前に決定された空白値を減算します。</li>
</ol>
4. Ussingチャンバー法を用いた電気生理学的輸送研究
注:電気生理学的輸送研究の決定は、上皮によって分割された2つのチャンバーコンパートメントで構成されるUssingチャンバーを使用して行われます。このチャンバーは、Ag/AgCl電極によって電圧クランプに接続されています。この技術により、電圧クランプによって誘発される短絡電流(Isc)の変化と、オームの法則によって計算された組織抵抗(RT)の変化を通じて、上皮の活発な電気発生輸送プロセスを追跡できます。Isc と Rt は、実験全体を通じて 6 秒ごとに記録されます。実験中、調査した組織をカルボゲンで曝気し、修飾したKrebs-Henseleit溶液とインキュベートして、生存可能な条件を確保します。インドメタシン(10μM)を緩衝液に添加して、プロスタグランジン合成を阻害します26。
<ol>
	<li>粘膜および漿膜緩衝液を37°Cにウォームアップし、カルボゲンで曝気します。個々のチャンバーごとに空のインサートを使用して、単一のチャンバーを組み立てます。トランズウェルの頂端側がすべて同じ方向を向いていることを確認してください。</li>
	<li>すべてのチャンバーに5 mLの予熱した粘膜緩衝液を満たします(表2)。電圧からのすべての電極を接続しますamp 製造元の指示に従って、個々のチャンバーに。正しい測定を確実にするために、気泡が電極に干渉していないことを確認してください。</li>
	<li>これらの条件でUssingチャンバーソフトウェアを校正するには、電圧クランプソフトウェアの Rf/dpi ボタンをクリックします。使用するすべての空のインサートの抵抗は等しく(~70Ω)、電流は約0mV(±5mV)である必要があります。一部のチャンバーでこれに当てはまらない場合は、システム内の電極または気泡の適切な配置を確認してください。</li>
	<li>すべての電極を取り外し、使用済みの緩衝液を廃棄します。すべての個々のチャンバーを開き、空のインサートを取り外します。個々のチャンバーの順序が維持されていることを確認してください。</li>
	<li>インサート付きのウェルプレートをインキュベーターから安全キャビネットに移動します。基底外側と頂端媒体を慎重に吸引します。</li>
	<li>500 μLの温かい粘膜緩衝液(37 °C)を頂端チャンバーに、3 mLの漿液緩衝液を基底外側チャンバーに添加して細胞を洗浄します。バッファーを吸引し、2回繰り返します。</li>
	<li>プレートからインサートを取り外します。インサートのサポートをそっと取り外します。インサートをUssingチャンバーにセットし、インサートの向きがキャリブレーションフェーズ中と同じであることを確認します。 図2に示すように、個々のチャンバーを組み立てます。</li>
	<li>細胞の基底外側側に面したチャンバーに5 mLの漿液緩衝液(表2)を充填し、頂端チャンバーに面したチャンバーに5 mLの粘膜緩衝液を充填します。</li>
	<li>電極とエアレーションチューブを各チャンバーに接続します。Ussingソフトウェアで測定を開始します。15分間平衡化します。</li>
	<li>条件を開回路状態から短絡状態に変更します。5分から10分間平衡化します。10 μMのフォルスコリンを漿膜チャンバーに加えます。 注:フォルスコリンの追加は、個々の腸のセグメントや研究課題に応じて、他の薬剤/物質に置き換えられる場合があります。.</li>
	<li>15分後、フォルスコリンと同じ方法で薬剤を追加するか、測定を停止します。エアレーションチューブと電極を個々のチャンバーから取り外します。両方のチャンバーの緩衝液をボウルに注ぎます。</li>
	<li>チャンバーを分解し、インサートを廃棄するか、フォローアップ分析(免疫組織化学や発現分析など)に使用します</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67666/67666fig02.jpg"> 
図2:Ussingチャンバーの概略図。 表示されているのは、成長した2D単分子膜を持つ膜で分割された両方のチャンバーです。両方のチャンバーはカルボゲンで曝気されています。電圧と電流は、チャンバーごとに2つの電極によって監視されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67666/67666fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
5. Ussingチャンバーのセットアップによって生成されたデータの分析
<ol>
	<li>電圧クランプソフトウェアによって生成されたデータを適切なスプレッドシートエディタにインポートします。</li>
	<li>基礎 Isc 値と Rt 値を決定するには、短絡条件を初期化してから 10 分後に取得した 10 個の連続データ点の平均を計算します。個々のチャンバーは技術的な複製として機能し、オルガノイドのすべての通過は生物学的複製として機能します。</li>
	<li>適用されたエージェントの影響を評価するには、エージェントの追加直前に 10 個の連続するデータ ポイントの平均を計算します。この平均を、エージェントが適用された後に観測された最大値(または最小値)と比較します。得られたデータは、平均±標準偏差(SD)として表示されます。</li>
</ol>

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<li>Markov, A. G., Veshnyakova, A., Fromm, M., Amasheh, M., Amasheh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+expression+of+claudin+proteins+correlates+with+tight+junction+barrier+properties+in+rat+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+B%22%5BJournal%5D)">Segmental expression of claudin proteins correlates with tight junction barrier properties in rat intestine.</a> J Comp Physiol B. 180 (4), 591-598 (2010).</li>
<li>Pearce, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marked+differences+in+tight+junction+composition+and+macromolecular+permeability+among+different+intestinal+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Marked differences in tight junction composition and macromolecular permeability among different intestinal cell types.</a> BMC Biology. 16 (1), 19(2018).</li>
<li>Legen, I., Salobir, M., Kerc, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+different+intestinal+epithelia+as+models+for+absorption+enhancement+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Comparison of different intestinal epithelia as models for absorption enhancement studies.</a> Int J Pharm. 291 (1-2), 183-188 (2005).</li>
<li>Moeser, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress+signaling+pathways+activated+by+weaning+mediate+intestinal+dysfunction+in+the+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Stress signaling pathways activated by weaning mediate intestinal dysfunction in the pig.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 292 (1), G173-G181 (2007).</li>
<li>Moeser, A. J., Ryan, K. A., Nighot, P. K., Blikslager, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastrointestinal+dysfunction+induced+by+early+weaning+is+attenuated+by+delayed+weaning+and+mast+cell+blockade+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Gastrointest+Liver+Physiol%22%5BJournal%5D)">Gastrointestinal dysfunction induced by early weaning is attenuated by delayed weaning and mast cell blockade in pigs.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (2), G413-G421 (2007).</li>
<li>Seamon, K. B., Padgett, W., Daly, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forskolin%3A+unique+diterpene+activator+of+adenylate+cyclase+in+membranes+and+in+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Forskolin: unique diterpene activator of adenylate cyclase in membranes and in intact cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 78 (6), 3363-3367 (1981).</li>
<li>Herrmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segmental+diversity+of+electrogenic+glucose+transport+characteristics+in+the+small+intestines+of+weaned+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Comp+Biochem+Physiol+A+Mol+Integr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Segmental diversity of electrogenic glucose transport characteristics in the small intestines of weaned pigs.</a> Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 163 (1), 161-169 (2012).</li>
<li>Wright, E. M., Martin, M. G., Turk, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+absorption+in+health+and+disease--sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Pract+Res+Clin+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Intestinal absorption in health and disease--sugars.</a> Best Pract Res Clin Gastroenterol. 17 (6), 943-956 (2003).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>24ウェルプレート</td><td>SARSTEDT AG & Co. KG</td><td>8,33,922</td><td></td></tr><tr><td>A83-01</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10432</td><td>Store at -20 &deg;C. Thaw when needed</td></tr><tr><td>accujet S</td><td>Brand GmbH + Co KG, Wertheim, Germany</td><td>26351</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12 Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>12634010</td><td>4 °Cで保管;C</td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>17504044</td><td>-20 > C. 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>CaCl2.2 H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt,</td><td>Germany C3306</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>D(+)-Glucose (wasserfrei)</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.08337</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>DAPT</td><td>MedChemExpress、ニュージャージー州、米国</td><td>HY-13027</td><td>-20°Cで保存 必要に応じて解凍</td></tr><tr><td>D-Mannitol</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>M4125</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich、シュネルドルフ、ドイツ</td><td>154938</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>電極セット (AgCl/PtIr/Std.)</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>#1316</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, ハンブルク, ドイツ</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus&nbsp;</td><td>Eppendorf SE, ハンブルク, ドイツ</td><td>3123000047</td><td></td></tr><tr><td>EVOM3 Manual Epithelial Volt Ohm Meter</td><td>World precision instruments, Sarasota, USA</td><td>EVM-MT-03-01</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>F7524</td><td>-20°Cで保存 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>F6886</td><td>-</td></tr><tr>20°Cで保存 必要に応じて解凍<td>gasprofi 1 SCS micro</td><td>WLD-TEC GmbH, Arsenhausen, Germany</td><td>60,04,000</td><td></td></tr><tr><td>Gastrin 1</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-P1097</td><td>Store at -20 &deg;C. 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>35050061</td><td>4°Cで保存</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>1090571000</td><td>室温で保管</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>H0887</td><td>4 °Cで保管;C</td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Class II Biological Safety Cabinet</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>51033316</td><td></td></tr><tr><td>Incubator ICO105</td><td>Memmert GmbH + Co.KG, Schwabach, Germany</td><td>62,20,143</td><td></td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>I7378</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.04936</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>L-グルタミン</td><td>Sigma-Aldrich、シュネルドルフ、ドイツ</td><td>G7513</td><td>-20°Cで保存 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>LWRN上清は</td><td>自作&nbsp;</td><td></td><td>-20°Cで保管し、必要に応じて解凍します。軽水管サプリメントは、Miyoshi et al. (2012)</td></tr><tr><td>Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL</td><td>Corning Incorporated - Life Sciences</td><td>354234</td><td>Store at -20 &deg;C. 必要に応じて氷上で慎重に解凍します</td></tr><tr><td>Megafuge 1.OR</td><td>Heraeus Instruments, Osterode, Germany</td><td>75003060</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6 H2O</td><td>Merck KGaA, ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1.05833</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>Na2HPO4.2H2</>O</td><td>Merck KGaA、ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1.06580</td><td>室温で保存</td></tr><tr><td>N-アセチル-L-システイン</td><td>Sigma-Aldrich、シュネルドルフ、ドイツ</td><td>A7250</td><td>-20°Cで保存 必要に応じて解凍</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck KGaA, ダルムシュタット、ドイツ</td><td>1.06404</td><td>室温で保管</td></tr><tr><td>NaH2PO4.H2O</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06346</td><td>室温での保存</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merck KGaA, Darmstadt, Germany</td><td>1.06329</td><td></td></tr><tr><td>Neubauerの改良チャンバー</td>での保存 <td>Glaswarenfabrik Karl Hecht, Sondheim vor der Rh&ouml;n, ドイツ</td><td>40442712</td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX70 iverted microscope</td><td>Olympus Corporation, Hamburg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>15140122</td><td>-20°Cで解凍</td></tr><tr><td>必要に応じて解凍 PolymyxinB</td><td>Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Germany</td><td>P4932-1MU</td><td>-20°Cで保存 必要に応じて解凍</td></tr><tr><td>Primovert顕微鏡スタンド双眼フォトチューブ付き</td><td>Zeiss</td><td>415510-1101-000</td><td></td></tr><tr><td>rm EGF</td><td>Prepotech, New Jersey, USA</td><td>315-09</td><td>-20°Cで保存 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>SB202190</td><td>MedChemExpress, New Jersey, USA</td><td>HY-10295</td><td>-20 °Cで保存 必要なときに解凍</td></tr><tr><td>Snapwell 3801</td><td>Corning Incorporated - ライフサイエンス</td><td>3801</td><td></td></tr><tr><td>トリプシン/EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Base System</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>#1317</td><td></td></tr><tr><td>Ussing Diffusion Chamber</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>SKU 1307</td><td></td></tr><tr><td>Voltage/Current Clamp VCC6</td><td>Scientific Instruments, Simmerath, Germany</td><td>SKU 1310</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>MedChemExpress, New Jersey、米国</td><td>HY-10583-20</td><td>°Cで保管してください。</td></tr></tbody></table>

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

Two-dimensional Porcine Intestinal Organoids Reflecting the Physiological Properties of Native Gut

このプロトコルは、ブタの空腸および結腸に由来する3Dオルガノイドを分解することにより、ブタの2D単分子膜の信頼性の高い生成を促進します。空腸オルガノイドは16日間、結腸オルガノイドは9日間の培養期間で、無傷の単分子膜が形成されます。これらの単分子膜は、その後、Ussingチャンバー技術を使用して電気発生的および生理学的輸送特性を評価するために使用できます。
3Dオルガノイドを崩壊させた後、単一細胞をコーティングされたインサートに播種します。細胞増殖は、各媒体交換中に経上皮電気抵抗(TEER)値を測定することによって監視されます。このアプローチにより、細胞増殖と、機能的な上皮の確立に不可欠な無傷の単分子膜の形成の両方を追跡することができます。当初、TEER値はベースラインに近いですが、培養期間にわたって徐々に増加し、18日後に空腸オルガノイド(図3A)で約150 Ω*cm2、9日間の培養後に結腸オルガノイド(図3B)で約200 Ω*cm<sup...

The gastrointestinal tract (GIT) serves both in the digestion of food and the uptake of nutrients but also as a protective barrier against pathogens. ...

two-dimensional-porcine-intestinal-organoids-reflecting-physiological

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

このプロトコルは、極性が逆の小腸炎を利用し、頂端表面へのアクセスを可能にする頂端外壊死性腸炎(NEC)-in-a-dishモデルを記述する。NEC関連上皮破壊を検出するための免疫蛍光染色プロトコールと、NECインディッシュプロトコルに供するアピカルアウトエンテロイドの生存率を決定する方法を提供します。...

インビトロ 壊死性腸炎の頂端外腸炎モデル

本プロトコルは、クローディン-7ノックアウトモデルにおける結腸幹細胞の活性および機能を研究するためのマウス結腸オルガノイド系の確立を記載する。...

腸幹細胞機能をex vivoで研究するためのマウス結腸陰窩の三次元培養

ここでは、凍結保存された上皮陰窩からブタ腸管3Dオルガノイドを培養するためのプロトコルを記載する。また、3Dオルガノイド由来の細胞単分子膜を確立し、上皮細胞の頂端側へのアクセスを可能にする方法についても説明します。...

凍結保存された上皮陰窩からの子豚腸3Dオルガノイドの培養と細胞単分子膜の樹立

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

イヌ腸オルガノイドとGut-on-a-Chipマイクロ流体システムの統合により、ヒトの腸疾患に関連するトランスレーショナルモデルが提供されます。提示されたプロトコルは、腸の3D形態形成と動的 in vitro モデリングを可能にし、One...

炎症性腸疾患患者由来の腸管オルガノイドを用いたイヌ腸チップの3次元形態形成

エンテロイドは、組織生理学や病態生理学、医薬品開発、再生医療を研究するための新しいモデルとして浮上しています。ここでは、関連する組織細胞タイプとの共培養を可能にするウシ初代細胞2Dエンテロイド由来培養システムについて説明します。このモデルは、消化器研究のモデリングにトランスレーショナルな利点をもたらします。...

トランスレーショナルバイオメディカル研究への応用を目指したウシ一次エンテロイド由来2次元単層培養系の作製

この研究は、オルガノイドからウシ腸の2D単分子膜を生成するためのプロトコルを提示し、宿主と病原体の相互作用を研究するためのアクセスを改善します。これには、膜の完全性と機能性を評価する方法が含まれており、牛の胃腸生理機能を模倣した in vitro...

小腸および大腸単分子膜界面を用いたウシオルガノイド技術の進歩

このビデオでは、シロアリの後腸内に常駐微生物の種からDNAを抽出する手法を示しています。腸内の微生物群集を視覚化するのに便利ですウェットマウントスライドの準備も図示され、そして種が豊富な腸内環境を経由してツアーが与えられます。...

シロアリの腸内微生物（Zootermopsis Angusticollis）からDNAを抽出し、腸内微生物の可視化

学ぶ ブタ腸管オルガノイドを用いた二次元単層培養法。TEER測定とUssingチャンバー実験で、生体内輸送特性を再現するモデルを構築し、従来の動物実験に代わる消化管生理学研究の新たな手法を確立する。

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

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