マウス肺への液体送達の方法論の改善:消費者向け耳鏡を使用した挿管

[アナウンサー]マウス肺への液体送達のための改良された方法論消費者耳鏡を使用した挿管。すべての動物の手順とこの内容は、チューレーン大学比較医学部によってレビューされ、プロトコル 1810 で承認されています。続行する前に、IACUC の承認を求め、施設の獣医スタッフに相談してください。新しい肺治療薬の開発は、マウス肺への信頼性が高く再現性のある送達に依存していますが、伝統的に鼻腔内投与、舌全体による中咽頭吸引、または外科的カットダウンに依存してきました。次の方法は、舌がいっぱいと比較してばらつきを減らし、より小さな動物コホートを可能にします。また、カットダウンよりもはるかに侵襲性が低いです。手順、ステップ1、セットアップ。げっ歯類の挿管キットは当初、挿管安全ウェッジ付きの船を使用していました。これらは、20 ゲージの 1 インチのフレキシブル カテーテルに収まる小さな円錐形のスリーブです。カテーテルが気管部を損傷するのを防ぎます。安全ウェッジを使用する前に、イソプロパノール準備パッドで安全ウェッジを清掃してください。クリーンな安全ウェッジ(ここでは緑色)を20ゲージのフレキシブルカニューレにスライドさせます。市販の耳鏡、携帯電話、ノーズコーン付きマウススタンド、曲がった細かい鋸歯状の鉗子、気管内チューブ、光ファイバーライト(使用している場合)など、必要なその他のツールを集めます。使用前に、これらすべてをイソプロパノール準備パッドで洗浄してください。長さ約20センチのフレキシブルチューブを取ります。U字型に曲げて、一端にルアーロック接続を追加します。ツイストタイでU字型を固定します。2〜300マイクロリットルの滅菌ろ過水またはインドインクをチューブに加えます。以下、このアセンブリをバブルチューブと呼びます。13センチメートルのサイズゼロ定格のシルク縫合糸を円に結んで縫合ループを取ります。このループをマウススタンドの上部に置き、縫合糸の両側がしっかりと固定されていることを確認します。マウススタンドを金属製の拡大灯ベースの上に置きます。マウスの口がある場所の周りに補助手を置きます。誘導チャンバーにマウスを置きます。毎分0.8リットルの一定流量の酸素と2%イソフルランを使用します。ノーズコーンの配置中に目覚めないようにマウスを十分に麻酔します。マウスの呼吸数を著しく抑制しないでください。定期的な呼吸は声帯を鑑賞するのに役立ちます。耳鏡を携帯電話に接続し、ビデオフィードが安定していることを確認します。注意、この手順中の研究者のイソフルオラン曝露を最小限に抑えるために、この方法で複数回挿管またはトレーニングを行う場合は化学呼吸器を使用してください。または、数本の木材で手順を実行します。ステップ2、動物のステージング。最初の動物が眠ったらすぐに誘導室から連れ出します。それらを首筋にし、縫合糸の長さに上の歯を置きます。マウスをスタンドに戻しながら、動物に軽い張力を加えて縫合糸の位置を維持します。首の角度を少し後ろに調整し、首を5〜15度軽く伸ばします。ノーズコーンを鼻孔の上にそっと押します。ノーズコーンをしっかりと押し下げると、マウスを吊り下げる縫合糸の邪魔になる可能性があるため、しないでください。大きくて細かく鋸歯状の曲がった鉗子を使用して、舌をできるだけ下唇に近づけてしっかりとつかみます。しっかりと下に引っ張って、上の歯から離し、下の歯の側面に引き寄せます。注意、長時間の牽引、過度の緊張、または舌の押しつぶしは、動物の健康を損なう可能性があります。あざ、出血、腫れ、舌の乾燥などの外傷の兆候がないか監視してください。観察された場合は、手順を中止し、獣医スタッフに警告してください。補助手を使用する場合は、この位置で鉗子を支えます。挿管安全ウェッジを所定の位置に置いた状態でフレキシブルカテーテルを通して使用する場合は、光ファイバーライトを供給します。ステップ3、声帯と挿管の視覚的鑑賞。耳鏡を利き手ではない手に持って、舌を軽く押します。 次に、カメラとその光源の角度を調整して、舌の付け根近くの声帯を視覚化します。解剖学的構造と組織の色にわずかな違いがあるため、呼吸に関連する動きを使用して構造の識別を確認します。最初に始めるときは、ビデオフィードで方向を向けるのが難しい場合があります。これらは偽の声帯です。これらが真の声帯です。これは頬組織からの反射です。これがプローブと光ファイバーライトです。これが喉頭蓋です。これが軟口蓋です。これが声門外膜であり、挿管の対象です。これは耳鏡の唇で、舌を押し下げます。ここは立ち入り禁止地域です。光ファイバーライトを点灯した状態で、耳鏡と一緒にカニューレに栄養を与え、舌の付け根または耳鏡の唇の部分に軽く接触させます。ちなみにカテーテルの接近角度を非常に浅く調整しよう。カテーテルを挿入した直後に、声帯から1ミリメートル未満のところに、カテーテルの先端をベンチトップとほぼ平行になるように持ち上げます。これにより、喉頭蓋がカテーテルを食道の背側に押し込むのを防ぎます。カテーテルを前進させるときに抵抗がほとんどあってはならないことに注意してください。抵抗が発生した場合は、すぐにカテーテルを取り外し、呼吸が正常に戻るまで待ちます。出血が観察された場合は、獣医師に相談してください。ステップ4、気管内チューブ留置の確認。耳鏡を使用してチューブが正しい位置にあることを視覚的に確認することに加えて、気管は食道よりも留置中の抵抗が少なくなります。光学的挿入深さは声帯から約5ミリメートルです。光は、挿入の深さが適切であることを確認する二次的な方法として、首を通して見ることができます。挿管安全ウェッジは、気管内チューブの留置の深さが深すぎるのを防ぐ必要があることに注意してください。安全ウェッジはコリーナへの外傷を防ぎますが、前進を妨げる必要はありません。次に、気管内チューブを所定の位置に保持しながら、光ファイバーライトを取り外します。バブルチューブ法でカテーテルの適切な配置を確認します。下部ロックを使用してバブルチューブを所定の位置に固定します。一回換気量はすぐに明らかになるはずです。そうでない場合、気管内チューブは置き忘れられています。すぐに取り外して、マウスの通常の呼吸数に戻します。ステップ5、気管内送達。中咽頭分娩の舌を引っ張る方法と同様に、挿管による分娩は動物を溺死させる危険があります。思春期および成体のマウスでは、50マイクロリットルは一般的に安全な量の液体を供給し、肺全体に広がるのに十分です。投与にピペットを使用する場合は、必要な量をカテーテルに直接ピペットで入れ、マウスに溶液を吸入させます。肺への拡散送達を確実にし、さらに最大500マイクロリットルの空気で肺に送達された液体を確実にします。必要に応じて、供給された液体の負の吸引のリスクを冒すことなく、ピペーターを複数回押し下げることができます。接種物を空気で洗い流すときは、一回換気量を超える約200マイクロリットルの使用が必要になる場合があることに注意してください。ただし、500マイクロリットルの使用は肺活量の約半分にすぎないため、外傷のリスクはありません。ステップ6、配信の評価。ハンドヘルド光ファイバーライトは、安価で簡単に入手できるコンポーネントから作ることができます。ここに示すように、市販の光ファイバー アセンブリを使用できます。ただし、50 mm のプラスチック光ファイバー ケーブルが供給される 20 ゲージの針を使用して穴を開けた 75 ml の円錐形のチューブの蓋で十分です。このビデオでは、市販のデバイスとハンドメイドのデバイスの両方が使用されました。代表的な結果として、挿管を使用した気管内送達は、舌を引っ張るによる中咽頭吸引と比較して、送達が改善され、ばらつきが減少します。舌を引っ張るとガイド下挿管の直接比較。 経験が埋もれているか、50マイクロリットルの希釈インドインクを舌を引っ張って口咽頭に独立して送達するよう依頼された3人の異なる研究者を、男女ともに10〜12週齢のC57 BL / 6Jマウスに送達しました。2人の研究者も、説明されているように挿管を介して同じストックと量のインクを肺に送達しました。肺は出産直後に摘出され、2倍の倍率で撮影されました。写真は、画像 J を使用して独立した盲検研究者によって染色された領域について評価されました。彼女は、挿管を使用すると、より多くの肺領域が染色されることを発見しました。さらに、挿管後の気管内送達が舌を引っ張るのではなく使用された場合、平均からの偏差率として表される変動性は減少しました。ガイド付き挿管に使用されるこのステーションは、図のように準備されます。左から、分娩用ピペット、気管内チューブの適切な配置を確認するためのバブルチューブ、鉗子、ヘラ、小児用鼻鏡、補助手、拡大灯、ノーズコーン付きマウススタンド、光ファイバープローブ、麻酔導入チャンバー。挿管により、OP 吸引に比べて変動が少なく、肺への送達が大きくなります。10週齢の雌の弁Cマウスに、AIV 6.2ルシフェラーゼの10〜11番目のVGを1回投与し、7日後にin vivo生物発光イメージングで評価しました。イメージングの10分前に、ルシフェリンを皮下注射しました。舌を引っ張るか挿管による気管内設置に続いて OP 吸引によって AV 6.2 ルシフェラーゼを投与されたマウスの代表的な a-vis 画像が示されています。舌を引っ張ることによる中咽頭吸引は、上気道のさまざまな部分に信号が分布しましたが、挿管は肺に信号が集中しました。関心領域は同じ領域であり、領域内の平均輝度が画像に表示されます。ルシフェラーゼシグナルの定量化により、挿管による肺への送達効率の向上が明らかになり、この方法を使用した送達のばらつきがさらに低減されることが強調されました。結論、前の図に見られるように、従来の舌引き法を使用した肺間接種は、斑状で一貫性のない接種物分布を示し、肺に到達する量のばらつきが大きくなります。対照的に、挿管法は、右肺と左肺の両方へのより一貫した送達につながり、変動が少なかった。この挿管法の確実に実証された肯定的な結果は、1 つは、マウスの肺に最大 50 マイクロリットルを再現可能な設置できること、2 つは肺全体に点滴された液体がびまん分布していること、3 つが肺を越えた接種物の広がりの減少です。この方法は高速かつ安全であり、高価な機器や時間のかかるトレーニングなしで実験室の手順に組み込むことができます。