下流のタンパク質分析のための結 核菌 からの細胞壁および細胞膜タンパク質の分離と分画

私たちの研究は、結核菌の不溶性細胞壁および細胞膜タンパク質を単純な画分に分離し、直接プロテオミクスおよび免疫学的アッセイを行う合理化された方法の開発に焦点を当てました。電気泳動技術の進歩により、複雑なタンパク質をより少ないタンパク質画分に分離できるようになり、機能的プロテオミクスおよび免疫学的応用のための効率的な質量分析ベースの単離が容易になりました。主な課題には、100ミリグラムを超える沈殿する疎水性タンパク質の溶解性が低いことや、SDS-PAGEによる変性があり、酵素活性アッセイなどのネイティブ確認を必要とする下流のアプリケーションが妨げられます。

現在のプロトコルでは、不溶性疎水性細胞壁および細胞膜タンパク質を定義された水溶性画分に体系的に分離して、直接プロテオミクスおよび免疫学的分析を行うものはありません。私たちの今後の研究は、より良い疾病管理をサポートすることを目的として、T 細胞抗原ベースの診断法の開発と、結核集団全体の感度、特異性、および性能を評価することに焦点を当てます。まず、結核菌の全細胞溶解物から細胞壁、細胞膜、および細胞質ゾルタンパク質サンプルを取得します。

細胞壁と細胞膜タンパク質を等電点集束バッファーに可溶化します。pH範囲3〜10および4〜6の間に2%両性電解物を1〜4の比率で添加します。次に、冷却水浴で摂氏4度に維持された液体等電点集束システムで可溶化タンパク質を分別します。

製造元の指示に従って、12ワットの定電力を印加して等電点集束分離を行います。真空ポンプで個々の等電点集束画分を収集します。各画分のpH値を決定します。

分離した画分の50マイクログラムをSDS-PAGEに照射し、クマシーブリリアントブルーまたは銀染色を使用してタンパク質を視覚化します。まず、IEFで分離した細胞壁および細胞膜画分をSDSゲル電気泳動サンプルバッファーと混合します。混合物を摂氏95度で5分間加熱します。

12.5%の分解能ゲルと4%のスタッキングゲルを備えた16 x 20センチメートルのポリアクリルアミドゲルを使用して、2次元でタンパク質画分を分離します。次に、長さ13センチメートルのサンプルウェルを1つ使用して、サンプルをゲルにロードします。色素の前面がゲルの底に到達するまで、ゲルあたり50ミリアンペアの定電流で電気泳動を実行します。

電気泳動後、溶出バッファー中でゲルを10分間平衡化します。機器メーカーの指示に従って、ゲルをゲル溶出装置全体に移します。溶出器を250ミリアンペアの定電流で1時間稼働させてゲルからタンパク質を溶出させ、真空ポンプを使用してゲルから約30個のタンパク質画分(それぞれ3ミリリットル)を回収します。

ビシンコニン酸タンパク質アッセイを使用して、溶出画分中のタンパク質濃度を定量します。溶出したタンパク質画分の10マイクログラムをSDS-PAGE分析にかけ、クマシーブリリアントブルー染色によってバンドを視覚化します。結核菌の最初の上清(細胞壁、細胞膜、および細胞質ゾル画分)で異なるタンパク質バンディングパターンが観察され、細胞内分画の成功が確認されました。

細胞壁タンパク質の等電点集束は、pHが2.5未満の画分で最も高いタンパク質濃度を示しました。細胞壁IEF画分のSDS-PAGEは、主に画分1〜8で、異なるタンパク質バンドを明らかにしました。IEFによる細胞膜タンパク質分離により、pH 4 と pH 10 の間の主要なタンパク質濃度ピークが明らかになり、最高濃度は pH 10 付近で発生しました。

細胞膜IEF画分のSDS-PAGEは、画分1〜9でより明確なバンドを持つ多様なタンパク質プロファイルを示しました。IEF分離された細胞壁タンパク質の分取SDS-PAGE分離により、主に100マイクログラム/ミリリットル未満の画分が生成されました。溶出した細胞壁タンパク質画分のSDS-PAGEは、広範囲のタンパク質分子量を示し、フラクション6〜10でより濃縮されたバンドを示しました。

細胞膜タンパク質画分の分取SDS-PAGEは、画分の半数以上が50〜199マイクログラム/ミリリットルのタンパク質濃度を持っていることを明らかにしました。溶出した細胞膜タンパク質画分のSDS-PAGEは、レーン1〜8および13〜16に集中したバンドを示しました。