その場で分離チップを用いた難治性土壌細菌の分離と培養 (iChip)

微生物の豊富な蓄積は、土壌、水域、極限環境などの多様な自然環境に存在します。しかし、この膨大な生物多様性の活用は、実験室の方法や媒体によって大きく制限されています。この文化の壁を乗り越え、この生物多様性を活用することで、さまざまなバイオテクノロジーのニーズに対応し、地球規模の課題を解決できる可能性があります。

たとえば、抗菌薬耐性の発生は、世界の公衆衛生に設定されています。実験室で培養するのが難しい土壌細菌は、抗菌システムの世界的な課題に対処する上で価値のある強力な抗菌活性を持つ新しい生理活性化合物を生成する可能性があります。膨大な種類の環境微生物とその産物は、従来の実験室培養ベースの技術が同様の既知の微生物の分離につながることが多いため、調査されていません。この実験の目的は、IChip テクノロジーを使用して、難治性土壌細菌のハイスループット培養をその場で実証することです。本プロトコルでは、本技術の応用として、培養が困難な細菌のハイスループットin situ培養や抗菌産生菌の回収に利用できる本IChip技術の構築と利用を実証します。

[プレゼンター]まず、プレゼンテーションソフトウェアで絶縁チップの上部、下部、および中央プレートの予備設計を作成します。プレゼンテーションソフトウェアの形状の挿入オプションを使用して、IChipとして機能する必要な寸法の円を挿入します。内部に小さな円を挿入して、IChip チャネルを表します。小さな円を目的のパターンに配置して、IChip の上部、下部、および中央のプレートの予備設計を準備します。デザインを選択し、右クリックメニューを使用して、予備デザインを画像として保存します。予備設計をテンプレートとして使用し、コンピューター支援設計ソフトウェアを使用して 2 次元設計の作成を開始します。スケッチメニューから、定義済みの形状(主に円)を挿入して、IChipプレートの基本デザインとチャネルの領域を作成します。寸法オプションを使用して、プレートとチャネルの実際の寸法を設定します。[OK] をクリックしてデザインを完成させ、押し出し機能を使用して 2D デザインを希望の厚さの 3D モデルに変換します。最後に、ファイルメニューを使用して、3Dプリントと互換性のある静止リソグラフィファイル形式で3Dモデルのコピーを保存します。

[プレゼンター]土壌サンプルの収集に必要なすべての必須アイテムを収集し、サンプルを収集する場所に到着します。ジオコーディングモバイルアプリケーションを開き、サンプリングサイトの一意の3ワードアドレスを見つけて記録します。次に、温度、日付、時刻、サンプリングの深さ、天候、要素への現場の曝露など、関連するサンプルメタデータを記録します。シャベルとIChipを植えるポリスチレンボックスに70%エタノールをスプレーします。ティッシュペーパーできれいに拭き取り、エタノールを完全に自然乾燥させます。次に、除染されたシャベルを使用して、落ち葉や岩などの表面の破片を取り除き、表土を露出させます。以前と同じようにシャベルを再び除染します。シャベルを使用して、3〜6の深さの土壌にアクセスし、地下に摂取し、均一な深さから約4〜5kgの土壌をポリスチレンボックスに移します。ボックスは約75%満杯になっているはずです。採取した土は、すぐに実験室に運び戻します。収集した土壌サンプルから、破片、岩、落葉のない土壌1グラムを、10mlの滅菌生理食塩水を含む滅菌50mil遠心分離管に入れます。約10秒間渦巻きながら土壌と生理食塩水を混ぜて土壌スラリーを作ります。遠心分離管を5分間放置して、チューブ内の大きな土壌粒子を落ち着かせます。次に、上清土壌懸濁液をSとラベル付けされた新鮮な試験管に慎重に移します。土壌懸濁液を原液サンプルとして使用し、サンプル1mlを新鮮なチューブ内の滅菌生理食塩水9mlに移すことにより、ゼロ希釈を行います。10の累乗マイナス1から10の累乗マイナス5までの希釈を準備します。バイオセーフティキャビネット内で、70%エタノールに10分間浸すことにより、IChipの天板、底板、および中板の表面を除染します。IChipコンポーネントを滅菌脱イオン水で洗浄して余分なエタノールを洗い流し、滅菌ペトリ皿を自然乾燥させます。IChipの中央プレートを、播種の準備ができている滅菌ペトリ皿に入れます。SMS寒天培地を電子レンジで溶かします。冷ましてから、22.5mlのSMS寒天培地を45度で滅菌50ml遠心分離管に移します。これに、土壌サンプルの適切な希釈液2.5mlを加え、気泡の侵入を避けながら穏やかに反転してよく混合します。約3〜4mlの播種されたSMS寒天培地を、表面全体を覆うIChipの中央プレートにゆっくりと注ぎます。次に、SMS寒天培地を約5〜10分間硬化させます。SMS寒天培地が設定されているか確認してください。次に、滅菌カミソリの刃を使用して、IChip金属プレートの表面から余分なSMS寒天をこすり落とし、個々の拡散チャンバーに寒天プラグを残します。0.03マイクロメートルのポリカーボネートメンブレンフィルターの1つから保護シートを取り外した後、滅菌鉗子を使用してIChipの上部ブレードの内側に慎重に置きます。次に、滅菌鉗子を使用して、播種された金属プレートの露出側に別の0.03マイクロメートルのポリカーボネート膜フィルターを配置します。IChip の上部プレートと下部プレートを置き、中央のプレートとポリカーボネート膜を挟み込み、これらのネジ穴をすべてのプレートに合わせるように注意して IChip アセンブリを完了します。ナットとボルトをしっかりと締めて、IChipアセンブリを固定します。滅菌シャベルを使用して、ポリスチレンボックス内の土壌コレクターにIChipのサイズよりも大きいくぼみを作成します。IChipアセンブリをくぼみ内に垂直に植え、土をしっかりと詰めて、IChipのすべての表面が完全に覆われていることを確認します。次に、2〜4週間の所望の期間、培養中でその場で許可します。インキュベーション中は、滅菌蒸留水を使用して土壌周囲、植えられたIChipを定期的に湿らせ、拡散チャンバー内の播種されたSMS寒天プラグが乾燥するのを防ぎます。 希望のインキュベーション後、植えたIChipの周りの土をそっと取り除いて回復します。次に、IChipを滅菌生理食塩水で洗浄して付着した土壌粒子を除去し、バイオセーフティキャビネット内に移してさらに処理します。IChipアセンブリからナットとボルトを緩め、慎重にIChipを分解します。滅菌鉗子を使用して、ポリカーボネート膜を取り除き、IChipの中間プレートを準備したペトリ皿に移します。滅菌木製アプリケーターを使用して、各拡散チャンバー内の個々の寒天プラグを回収します。寒天プラグをSMS寒天や0.1Xトリプシン大豆ブロス寒天培地などの適切な培地に接種して、実験室での栽培を試みます。培養分離株は、テスター株を使用した寒天オーバーレイなどの日常的な方法で抗菌剤の生産についてスクリーニングできます。ここでは、黄色ブドウ球菌ATCC 29213およびアシネトバクターバウマンニB8342に対するIChip寒天プラグから得られた12の培養物、IC-1から12の代表的なスクリーニング結果を示します。培養物IC-6およびIC-8は、それぞれグラム陽性およびグラム陰性のテスター株に対して活性を示すことに注意してください。あるいは、その場で培養された難治性土壌細菌を含む回収された寒天プラグを染色して画像化し、その場条件下でのマイクロコロニーの増殖を確認します。このアプローチを使用すると、難治性土壌細菌をその場でハイスループットで回収することができます。3DプリントされたIChipは、156個の寒天プラグを収容できます。ただし、1つの細菌細胞がIChipの各チャネルに播種されるように、播種時に適切な希釈液を選択する必要があります。必要な細菌は、実験室の条件で培養できる場合、代謝物の生成、酵素の生成、生体高分子の生成など、必要な生物活性についてスクリーニングできます。ただし、一部の細菌は実験室の条件で増殖しない可能性もあり、そのような場合、微生物の存在を認識し、その生合成の可能性にアクセスするためにメタゲノムアプローチを採用する必要があるかもしれません。説明されている方法は非常に簡単で、わずかな変更を加えるだけで、さまざまな環境条件で微生物のバイオプロスペクシングに簡単に使用できます。