Name: ARL13B-CENTRIN-2マウスモデルを用いた筋骨格組織における原発性繊毛の体積イメージングと解析 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: 学ぶ 筋骨格組織における原発性繊毛の3次元イメージング手法。ARL13B-CENTRIN-2トランスジェニックマウスモデルを用いて、成長板内の繊毛の位置と方向性を可視化し、組織形態形成における繊毛の役割を解明する。

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<ol><li>Wheatley, D. N., Wang, A. M., Strugnell, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+primary+cilia+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Expression of primary cilia in mammalian cells.</a> Cell Biol Int. 20 (1), 73-81 (1996).</li>
<li>Donnelly, E., Ascenzi, M. G., Farnum, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+are+highly+oriented+with+respect+to+collagen+direction+and+long+axis+of+extensor+tendon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Primary cilia are highly oriented with respect to collagen direction and long axis of extensor tendon.</a> J Orthop Res. 28 (1), 77-82 (2010).</li>
<li>McGlashan, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+loading+modulates+chondrocyte+primary+cilia+incidence+and+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biol+Int%22%5BJournal%5D)">Mechanical loading modulates chondrocyte primary cilia incidence and length.</a> Cell Biol Int. 34 (5), 441-446 (2010).</li>
<li>Farnum, C. E., Wilsman, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orientation+of+primary+cilia+of+articular+chondrocytes+in+three-dimensional+space%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Orientation of primary cilia of articular chondrocytes in three-dimensional space.</a> Anat Rec. 294 (3), 533-549 (2011).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ciliary+protein+IFT88+controls+post-natal+cartilage+thickness+and+influences+development+of+osteoarthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Arth+Rheumatol%22%5BJournal%5D)">The ciliary protein IFT88 controls post-natal cartilage thickness and influences development of osteoarthritis.</a> Arth Rheumatol. 74 (1), 49-59 (2021).</li>
<li>Coveney, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+IFT88+protects+coordinated+adolescent+growth+plate+ossification+from+disruptive+physiological+mechanical+forces%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Ciliary IFT88 protects coordinated adolescent growth plate ossification from disruptive physiological mechanical forces.</a> J Bone Miner Res. 37 (6), 1081-1086 (2022).</li>
<li>Andrea, C. E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+organization+reflects+polarity+in+the+growth+plate+and+implies+loss+of+polarity+and+mosaicism+in+osteochondroma%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Primary cilia organization reflects polarity in the growth plate and implies loss of polarity and mosaicism in osteochondroma.</a> Lab Invest. 90 (7), 1091-1101 (2010).</li>
<li>Ascenzi, M. -G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+localization%2C+length+and+orientation+of+chondrocytic+primary+cilium+on+murine+growth+plate+organization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Effect of localization, length and orientation of chondrocytic primary cilium on murine growth plate organization.</a> J. Theor Biol. 285 (1), 147-155 (2011).</li>
<li>Bangs, F. K., Schrode, N., Hadjantonakis, A. K., Anderson, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lineage+specificity+of+primary+cilia+in+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Lineage specificity of primary cilia in the mouse embryo.</a> Nat. Cell Biol. 17 (2), 113-122 (2015).</li>
<li>Larkins, C. E., Aviles, G. D. G., East, M. P., Kahn, R. A., Caspary, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arl13b+regulates+ciliogenesis+and+the+dynamic+localization+of+Shh+signaling+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Arl13b regulates ciliogenesis and the dynamic localization of Shh signaling proteins.</a> Mol Biol Cell. 22 (23), 4694-4703 (2011).</li>
<li>Higginbotham, H., Bielas, S., Tanaka, T., Gleeson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+mouse+line+with+green-fluorescent+protein-labeled+Centrin+2+allows+visualization+of+the+centrosome+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Transgenic mouse line with green-fluorescent protein-labeled Centrin 2 allows visualization of the centrosome in living cells.</a> Transgenic Res. 13 (2), 155-164 (2004).</li>
<li>arivis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Application+Note+%2347+-+Applying+Cellpose+models+in+arivis+Vision4D%22">Application Note #47 - Applying Cellpose models in arivis Vision4D</a>. , 1-20 (2021).</li>
<li>Huff, J., Bergter, A., Luebbers, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+Note%3A+Multiplex+mode+for+the+LSM+9+series+with+Airyscan+2%3A+fast+and+gentle+confocal+super-resolution+in+large+volumes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Application Note: Multiplex mode for the LSM 9 series with Airyscan 2: fast and gentle confocal super-resolution in large volumes.</a> Nat Methods. , (2019).</li>
<li>Ning, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-associated+wound+repair+mediated+by+IFT88+in+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Cilia-associated wound repair mediated by IFT88 in retinal pigment epithelium.</a> Sci Rep. 13 (1), 8205-8219 (2023).</li>
<li>Palla, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+cilia+on+muscle+stem+cells+are+critical+to+maintain+regenerative+capacity+and+are+lost+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Primary cilia on muscle stem cells are critical to maintain regenerative capacity and are lost during aging.</a> Nat Commun. 13 (1), 1439-1451 (2022).</li>
<li>Brewer, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postnatal+dynamic+ciliary+ARL13B+and+ADCY3+localization+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Postnatal dynamic ciliary ARL13B and ADCY3 localization in the mouse brain.</a> Cells. 13 (3), 259-277 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>22 x 50 mmカバースリップフィ</td><td>ッシャーサイエンティフィック&nbsp;</td><td></td><td></td>12373128</tr><tr><td>arivis Vision4Dソフトウェア</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>画像解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>共焦点レーザー走査型顕微鏡&nbsp;</td><td>ツァイス</td><td>ツァイス 980 エアリスカン 2</td><td></td></tr><tr><td>カバーグリップ カバースリップ シーラント&nbsp;</td><td>ビオチウム&nbsp;</td><td>23005</td><td></td></tr><tr><td>クライオフィルム 3C(16UF) (シートタイプ) 2.0 cm 幅</td><td>セクションラボ</td><td>C-FUF303</td><td>セクションラボから直接購入</td></tr><tr><td>クライオスタット</td><td>ライカ</td><td>CM1900 UV</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベースモールド&nbsp;</td><td>epredia</td><td>58952</td><td></td></tr><tr><td>Dulbeccoのリン酸塩緩衝生理食塩水</td><td>gibco</td><td>14190</td><td></td></tr><tr><td>ホルマリン</td><td>シグマ</td><td>20260630</td><td></td></tr><tr><td>Imaris software&nbsp;</td><td>オックスフォード・インストゥルメンツ&nbsp;</td><td>N/A</td><td>3D再構成用画像解析ソフトウェア&nbsp;</td></tr><tr><td>イマージョンオイル518F</td><td>ツァイス</td><td>ISO 8036&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ミクロトームブレードフェ</td><td></td><td>ザー02.075.00.006</td><td></td></tr><tr><td>SlowFadeガラス退色防止マウンタント&nbsp;</td><td>invitrogen</td><td>S36917</td><td></td></tr><tr><td>ショ糖</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>スーパークライオエンベディングメディウム (SCEM)</td><td>Section-lab</td><td>C-EM001</td><td>Section-labから直接購入する</td></tr><tr><td>Superfrost Plus Microscope slides</td><td>avantor</td><td>631-0108</td><td></td></tr><tr><td>Zen software</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td>共焦点レーザー走査顕微鏡用フリーウェア</td></tr></tbody></table>

arl13b-centrin-2マウスモデルを用いた筋骨格組織における原発性繊毛の体積イメージングと解析

Volumetric Imaging and Analysis of Primary Cilia in Musculoskeletal Tissue using the ARL13B-CENTRIN-2 Mouse Model

6週齢マウスの成長プレートを、記載されたプロトコルおよび組織にマッピングされた一次繊毛組織を用いて画像化した。成長プレートの3つの領域(静止状態、増殖性、肥大性)すべての画像がキャプチャされ、分析パイプラインを通じて実行されました(図2A)。個々の細胞はDAPI染色で同定でき、毛様体軸索は赤、中心小体は緑です。この方法を使用した分解能は、個々の中心小体を識別するのに十分なほど高いです(図2B)。この解像度では、繊毛を3D環境で視覚化し、さまざまな方向を向くことができます(ビデオ1)。
また、低解像度の画像や高倍率の対物レンズを撮影することで、組織のより広い領域にわたる一次繊毛を可視化することもできます。ただし、これらは3Dでの繊毛配向の解析には適していません。例えば、関節軟骨の一次繊毛を20倍対物レンズで画像化し、この方法が他の組織にも有効であることを示しました(図2C)。この解像度では、赤の毛様体軸索を識別できますが、中心小体は識別が難しくなります。軟骨下骨はGFPバックグラウンドシグナルを多く提示する傾向があり、この組織における中心小体の同定を困難にしています。
このパイプラインは、個々の細胞、初代繊毛、中心小体を検出でき、高度に組織化された若い成長プレートや、10週齢のマウスのようにカラムがあまり明確に定義されていない古い成長プレートで機能します(図3)。細胞と繊毛は3Dで検出され、zスタック全体で表示できます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig01.jpg"> 
図1:実験ワークフロー。 組織収集から画像解析までのプロトコールのさまざまなステップのフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig02.jpg"> 
図2:ARL13B-CENTRIN-2マウスのマウス組織における一次繊毛。 (A)6週齢の成長プレートで、DAPIが白、CENTRIN-2が緑、ARL13Bが赤で、40倍対物レンズで画像化。(B)個々の一次繊毛とその2つの中心小体を拡大します。(C)20倍対物レンズで画像化された4週齢マウスの関節軟骨と軟骨下骨。(D)筋骨格組織と同じパイプラインを使用して画像化された6週齢マウスの腎臓。(E)腎臓内の個々の一次繊毛とその中心小体を示す D の白いボックスの拡大。スケールバー = 20 μm (A,D)、4 μm (B)、60 μm (C)、6 μm (E)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67693/67693fig03.jpg"> 
図3:細胞および繊毛検出パイプライン。 10 週齢の成長プレート上の画像解析パイプラインの適用例。(A)ソフトウェアで開いた画像。(B)細胞検出パイプラインの結果。(C)繊毛および中心小体検出パイプラインの結果。繊毛はピンク、中心小体は緑です。側面図は、解像度が3Dで異なる方向に向けられた繊毛を識別するのに十分な高いことを例示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/67693fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ビデオ1:ARL13B-CENTRIN-2マウスからの6週齢の成長板の3次元再構成。 立体再構成はImarisソフトウェアで行い、アニメーションビデオとして記録しました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Video-1.mp4" target="_blank">このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S1:顕微鏡システムでの画像取得設定。 (A)チャネルを追加し、Airyscanモードを選択するためのスマートセットアップウィンドウ。(B)タイルビューアは、画像にタイルを選択してプレビューします。(C)Airyscan検出器の調整ウィンドウ、すべてのタイルが緑色に変わると、Airyscan検出器の位置合わせが確認されます。(D)3つのチャンネルのレーザー設定。(E)取得モードとZスタック設定。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-1.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図S2:顕微鏡システムの画像処理設定。 (A)Airyscan処理設定。(B)ステッチ設定。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-2.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図 S3: カスタム画像分析パイプライン。 (A)GFPおよびDAPIチャネルを使用した細胞検出パイプライン。(B)mCherryチャネルとGFPチャネルをそれぞれ使用した一次繊毛および中心小体検出パイプライン。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67693/Supp-file-3-.zip" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

ARL13B-CENTRIN-2マウスモデルを用いた筋骨格組織における原発性繊毛の体積イメージングと解析

The primary cilium is a non-motile, solitary organelle assembled by most cell types. It is essential to the development and homeostasis of the skeleton ...

成長する四肢をよりよく理解するために、私たちは、環境に対する細胞の応答を調節する上で重要な役割を果たす細胞小器官である一次繊毛を研究しました。繊毛の成長における役割を調べるために、新しい骨が成長する軟骨の層である成長板内で繊毛をイメージングしています。一次繊毛は非常に小さく、長さは5マイクロメートル未満であるため、特に3次元でのイメージングが困難です。軟骨や骨など、マトリックスが豊富で部分的に石灰化した組織内でイメージングすると、その存在を正確に探索することは、位置、向き、サイズは言うまでもなく、さらに困難になります。成長プレート内のすべての細胞における一次繊毛の3D組織をマッピングし、病気の細胞が一次繊毛を組み立てるかどうか、組織の形態形成に関してどこでどのように配向しているかを尋ねることができます。一次繊毛は、これまで成長プレートまたは非常に少数の成長プレートで2Dでしか研究されていませんでした。繊毛および中心小体の内因性蛍光シグナルは、ノイズに対するシグナルが高いため、繊毛同定の信頼性をもたらし、免疫組織化学の必要性を回避します。また、このプロトコルでは、組織内の数百の繊毛をハイスループットで集団的にイメージングすることができ、研究している形態形成のイベントに繊毛を空間的に関連付けることができます。このイメージングおよび解析手法は、組織や臓器全体で一次繊毛をマッピングするために、他の組織にも適用できます。これにより、一次繊毛の構造と機能との間の関連性をより深く理解することができます。まず、マウス組織の調製した凍結凍結切片を取り、スライドを室温で水平に置いて解凍します。PBSを一滴垂らしてスライドを5分ずつ3サイクル洗浄し、偽物を取り除きます。10マイクロモルのDAPI溶液をスライドに塗布し、1分間染色します。次に、サンプルをマウントし、カバースリップで覆い、室温で一晩放置します。カバースリップシーラントを使用してカバースリップの端をシールします。共焦点顕微鏡をセットアップするには、電源を入れてソフトウェアを開き、システムボタンをクリックします。「Acquisition」タブで、「Smart Setup」をクリックしてチャンネルを設定し、GFP、mCherry、DAPIチャンネルを追加します。次に、解像度と速度の間のARIスキャントライアングルからARIスキャンオプションとsR8-Y機能を選択します。[Best Signal] をクリックし、[OK] をクリックして確定します。Locate タブの Microscope Control で、油浸の 40 倍対物レンズと 1.4 対物レンズを選択します。次に、スライドをスライドホルダーに置き、オイルがカバースリップに触れるまで対物レンズを持ち上げます。次に、成長プレートまたはその他の関心領域を光路の下に配置します。[Locate]タブで、[Fluorescence]をクリックし、[DAPI]を選択します。また、接眼レンズを使用して、ジョイスティックでスライドホルダーを動かし、成長プレートまたは関心のある領域を視野の下に配置します。[Acquisition] タブで、DAPI チャネルのみを選択します。[Continuous]をクリックして、画面にDAPIチャネルの画像を表示し、成長プレートが表示されていることを確認します。タイル ビューアを開くには、[タイル] タブの [ビューアの表示] をクリックします。必要な数のタイルを追加します (通常は X 方向に 1 タイル、Y 方向に 3 つから 5 タイル)。次に、[プレビューして開始]をクリックします。次に、タイルが成長プレートの3つのゾーン(休止、増殖、肥大)を覆っていることを確認します。必要に応じて、タイルの位置と数を調整します。画像パラメータを設定するには、[Acquisition]タブで[Continuous]をクリックします。ARIスキャン検出器の位置を合わせるには、下部にあるタイル状のロゼット記号をクリックして、ARIスキャン検出器の調整ウィンドウを開きます。すべてのタイルが緑色に変わるまで待ちます。[チャンネル]タブで、ゲインマスターとレーザー出力を調整して、画面上の核をはっきりと表示します。次に、3つのチャンネルをすべて選択し、[Continuous]をクリックしてイメージングを開始します。ARIスキャン検出器の位置を合わせます。[Acquisition Mode] タブで、画像サイズ、ピクセル サイズ、フレーム サイズ、速度、および平均化の値を定義します。[Acquisition] タブで、[Z-Stack] チェックボックスをオンにして [Z-Stack] イメージングを有効にします。次に、DAPIチャネルのみを選択し、[Continuous]をクリックして画面に画像を表示します。対物レンズを、撮像する最も近い平面に移動します。[Z-Stack] タブで [Set First Plane] をクリックし、最後に表示する平面に焦点を合わせ、[Set Last Plane] をクリックしてイメージング範囲を設定します。Z スタック平面の間隔を 0.15 マイクロメートルに設定します。Zスタックイメージング範囲の中央に移動します。[Tiles (タイル)] タブの [Tile Regions (タイル領域)] で、[Verify (検証)] をクリックし、[Set Z (設定 Z)] と [Move to Next (次へに移動)] をクリックします。次に、[フォーカス戦略] タブで、フォーカス戦略がタイル設定で定義された Z 値とフォーカス サーフェスを使用するように設定されていることを確認します。次に、[実験の開始]をクリックして画像の取得を開始します。画像を処理するには、[処理]タブに移動し、[シングルモード]または[バッチモード]を選択し、[ARIスキャン処理]を選択し、[3D処理]オプションにチェックマークを付けて、[標準自動フィルター]を選択します。取得したRAW画像を選択し、処理を開始します。ARIスキャン処理が完了したら、処理方法でスティッチングを選択します。[New Output]、[Fuse Tiles]、[Correct Shading]、および [All by Reference] を選択し、リファレンスを DAPI として設定します。ARIスキャン処理された画像を選択し、スティッチングプロセスを開始します。まず、取得したCZI画像ファイルをソフトウェアにインポートし、分析パネルを開きます。ドロップダウン メニューで、 [新しいパイプライン] を選択します。「操作を追加」ボタンを使用して、パイプラインに演算子を追加します。細胞検出パイプラインを作成するには、細胞ポスト Python セグメンターをパイプラインにインポートします。モデル名を Cyto 2 に、入力チャネルを 2 に、2 番目のチャネルを 3 に、マイクロメートル単位の直径を 10 に設定します。フローしきい値を 0.4 に、セル確率しきい値を 0 に設定します。次に、パイプラインの前に import document objects 演算子を追加し、名前を Import Manual Labels に変更します。次に、パイプラインの後にオブジェクト特徴フィルター演算子を追加し、名前を Size Filter に変更します。[ポリゴン] ツールを使用して、最初の平面と最後の平面に関心領域を描画します。作成したオブジェクトの名前を変更してタグ付けします。[分析] パネルの上部にある前方の青い矢印をクリックして、パイプラインを実行します。一次繊毛および中心小体検出パイプラインを作成するには、解析パネルを開き、ドロップダウンメニューから新規パイプラインを選択します。インポート ドキュメント オブジェクト、2 つのしきい値演算子、分割、オブジェクト、フィーチャ、フィルター、コンパートメントなどの演算子をパイプラインに追加および調整します。次に、[分析] パネルの上部にある前方の青い矢印をクリックして、パイプラインを実行します。[オブジェクト]ウィンドウを開き、セル、一次繊毛、および中心小体(ここではコンパートメントセル)を含むオブジェクトを選択し、[インポート/エクスポート]をクリックします。Excel エクスポート を選択します。子の数、名前、親名、3D指向の境界短辺、中間辺、長辺、角度XY、角度XZ、角度YZ、バウンディングボックスX1、X2、Y1、Y2、Z1、Z2、サイズX、サイズY、サイズZ、ジオメトリの中心X、Y、Z、平面の最初、最後、カウント、メッシュ、ボリュームメッシュ、表面積メッシュなどの機能を選択します保存します。一次繊毛組織は、6週齢のマウスの成長プレートで成功裏にマッピングされました。高解像度イメージングにより、個々の中心小体と一次繊毛を3次元環境で視覚化する能力が実証されました。細胞と一次繊毛は、画像解析パイプラインを使用して3Dで検出されるため、側面を向いている一次繊毛と後方を向いている一次繊毛を区別できます。

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Research

JoVE Journal

Biology

生物学

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ARL13B-CENTRIN-2マウスモデルを用いた筋骨格組織における原発性繊毛の体積イメージングと解析

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