多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

私たちは、開発中に特定の決定がどのように規制されるかを理解することに関心があります。オルガノイドモデルとシングルセロミクス技術により、これまで不可能だった疑問を投げかけることができます。in vitroオルガノイドモデルを使用することで、特に神経堤などの一過性細胞集団について、より多くのデータを生成することができます。

有意な変動性モデルの出力は、依然として主要な実験的課題です。私たちは、頭蓋堤細胞がprepotency genesを再発現して分化能を拡大することを示しました。まず、DMEMノックアウト培地に1ミリリットルあたり2ミリグラムの濃度で新鮮なコラゲナーゼ溶液を調製します。

70〜80%のコンフルエントmESCを含むウェルプレートからESC培地を吸引します。次に、ウェルの側面に1ミリリットルのPBSをそっと加えます。プレートを揺らして、均一に洗えます。

PBSをピペットで取り出し、2ミリリットルのコラゲナーゼ溶液と交換します。摂氏37度で30〜45分間インキュベートします。20分間のインキュベーション後、その後5分ごとに、光学顕微鏡で10倍の倍率でプレートを確認します。

コロニーの端が丸まったら、プレート側を強く叩いてコロニーを切り離します。5ミリリットルの血清ピペットを使用して、分離したコロニーを回収し、15ミリリットルの円錐管に移します。コロニーを16Gで室温で3分間遠心分離します。

下部のコロニーを乱さずに、円錐管からできるだけ多くの培地を吸引します。次に、0.05%トリプシン溶液1ミリリットルをペレットに加え、インキュベートします。P1000およびP200マイクロピペットを使用して、懸濁液を激しく上下にピペットで動かしてコロニーを解離し、次に2ミリリットルのmESC培地を追加してトリプシンをブロックします。

チューブを160 Gで室温で3分間遠心分離します。上清をピペットで取り出し、1ミリリットルのCNCC分化培地を追加します。自動細胞計数装置または顕微鏡下で細胞をカウントし、CNCC分化培地で細胞を希釈して、50マイクロリットルあたり3, 000個の生細胞の濃度を達成します。

P200マイクロピペットを使用して、非TC処理されたU底96ウェルプレートの各ウェルに50マイクロリットルの細胞懸濁液を播種します。各ウェルをCNCC分化培地で200マイクロリットルに補充し、インキュベートします。分化した細胞の24時間培養を含むプレートを光学顕微鏡で観察し、各ウェルの底に明確な境界を持つ小さなクラスターが見えることを確認します。

プレートをインキュベーターに一晩戻します。2日目に、各ウェルから100マイクロリットルの培地をゆっくりと取り出します。次に、先端を端から3〜4ミリメートルカットしたP200マイクロピペットを使用して、残りの培地とともにニューロスフェアを吸引します。

ニューロスフェアと残りの培地を、TC処理されていない平底の96ウェルプレートに移します。光学顕微鏡で転写を確認します。各ウェルに200マイクロリットルの予熱済みCNCC分化培地を上に置きます。

4日目に、各ウェルから100マイクロリットルの培地を吸引します。100マイクロリットルの予熱したCNCC分化培地と交換し、再度インキュベートします。5日目と6日目は、光学顕微鏡でニューロスフェアの付着を確認します。

ニューロスフェアから剥離する軽い細胞が本体を取り囲み始めることを確認します。与えられた組成に従ってCNCC維持培地を調製します。ウシ血清アルブミンを培地に加える前に、0.22マイクロメートルフィルターでろ過します。

成長因子を添加したら、培地を摂氏4度で最大3週間保管し、光から保護します。100マイクロリットルのフィブロネクチン溶液を、TC処理されていない96ウェルプレートの各ウェルに加えます。プレートが休んでいる間に、TC処理されていない平底の96ウェルプレートのウェルからできるだけ多くのCNCC分化培地を吸引します。

培地を50マイクロリットルのアキュターゼと交換します。摂氏37度で5分間インキュベートします。次に、100マイクロリットルのCNCC維持培地を各ウェルに追加して、アキュターゼを急冷します。

レシーブプレートのコーティングされたウェルからフィブロネクチンを除去します。次に、分離した回遊後CNCCを40マイクロメートルのフィルターで受入プレートのウェルにろ過します。所望の時点で、カットチップP200マイクロピペットを使用して、96ウェルプレートからニューロスフェアをDNA低結合の2ミリリットルチューブに移します。

ニューロスフェアを室温で3分間チューブ内に沈殿させた後、できるだけ多くの培地をピペットで取り出し、1ミリリットルの冷たいPBSですすいでください。埋込チャンバーを準備するには、顕微鏡スライド上に3層の両面透明ファイバーレステープを置きます。カミソリで、両面テープで3mm×8mmの窓を切ります。

ステレオスコープの下で、P200カットチップを使用して、クリアリング剤のニューロスフェアを慎重に取り付けチャンバーにピペットで移します。2倍から4倍までの倍率を使用して、チャンバー全体の視野を提供し、ニューロスフェアを特定します。チャンバー表面にカバースリップを敷き、その側面を軽く押して接着します。

非組織プレートのニューロスフェア培養では、5日目から均一な付着が見られましたが、ペトリ皿培養では、ニューロスフェアの付着と融合がさまざまで、特に4日目までに明らかになりました。ニューロスフィアのサイズ変動は、4日目と7日目のペトリ皿培養と比較して、96ウェルプレート培養で有意に減少しました。96ウェルプレートのニューロスフェアの直径は、4日目に139マイクロメートルから295マイクロメートル、7日目に383マイクロメートルから552マイクロメートルの範囲でしたが、ペトリ皿培養はより広い範囲を示しました。

ニューロスフェアの成長は細胞数の点で指数関数的であり、2日目の平均1, 082細胞から9日目には48, 352細胞に増加しました。直径の成長は直線的で、2日目の平均136マイクロメートルから9日目には570マイクロメートルに増加しました。免疫蛍光分析により、ニューロスフェアと剥離細胞は、9日目と13日目にCNCCマーカーAP2 alphaおよびSOX9、EMTマーカーTWIST1を発現することが確認されました。

PAX7はニューロスフェアにのみ存在していました。