Name: 多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-14T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: 学ぶ 頭蓋神経堤細胞の三次元試験管外分化プロトコル。マウス胚性幹細胞を用いて神経球サイズのばらつきを低減し、多重アッセイを可能にする方法です。発生生物学と再生医療の研究に有用です。

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<ol><li>Rothstein, M., Bhattacharya, D., Simoes-Costa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+basis+of+neural+crest+axial+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The molecular basis of neural crest axial identity.</a> Dev Biol. 444, S170-S180 (2018).</li>
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<li>Perera, S. N., Kerosuo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+road+again%3A+Establishment+and+maintenance+of+stemness+in+the+neural+crest+from+embryo+to+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">On the road again: Establishment and maintenance of stemness in the neural crest from embryo to adulthood.</a> Stem Cells. 39 (1), 7-25 (2021).</li>
<li>Nguyen, B. H., Ishii, M., Maxson, R. E., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+and+manipulation+of+O9-1+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culturing and manipulation of O9-1 neural crest cells.</a> J Vis Exp. (140), e58346(2018).</li>
<li>Ishii, M., Arias, A. C., Liu, L., Chen, Y. B., Bronner, M. E., Maxson, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+cranial+neural+crest+cell+line+from+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">A stable cranial neural crest cell line from mouse.</a> Stem Cells Dev. 21 (17), 3069-3080 (2012).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Prescott, S., Brugmann, S. A., Swigut, T., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenomic+annotation+of+enhancers+predicts+transcriptional+regulators+of+human+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Epigenomic annotation of enhancers predicts transcriptional regulators of human neural crest.</a> Cell Stem Cell. 11 (5), 633-648 (2012).</li>
<li>Cederquist, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+positional+identity+in+forebrain+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of positional identity in forebrain organoids.</a> Nat Biotechnol. 37 (4), 436-444 (2011).</li>
<li>Rada-Iglesias, A., Bajpai, R., Swigut, T., Brugmann, S. A., Flynn, R. A., Wysocka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+chromatin+signature+uncovers+early+developmental+enhancers+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans.</a> Nature. 470 (7333), 279-283 (2011).</li>
<li>Prescott, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+divergence+and+cis-regulatory+evolution+in+the+human+and+chimp+neural+crest%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Enhancer divergence and cis-regulatory evolution in the human and chimp neural crest.</a> Cell. 163 (1), 68-83 (2015).</li>
<li>Chaddah, R., Arntfield, M., Runciman, S., Clarke, L., van der Kooy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+neural+stem+cells+from+human+embryonic+stem+cell+colonies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Clonal neural stem cells from human embryonic stem cell colonies.</a> J Neurosci. 32 (23), 7771-7781 (2012).</li>
<li>Bajpai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHD7+cooperates+with+PBAF+to+control+multipotent+neural+crest+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation.</a> Nature. 463 (7283), 958-962 (2010).</li>
<li>Sipahi, R., Zupanc, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+cellular+automata+model+of+neurosphere+growth%3A+Roles+of+proliferative+potential%2C+contact+inhibition%2C+cell+death%2C+and+phagocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Theor+Biol%22%5BJournal%5D)">Stochastic cellular automata model of neurosphere growth: Roles of proliferative potential, contact inhibition, cell death, and phagocytosis.</a> J Theor Biol. 445, 151-165 (2018).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+neurosphere+size+on+the+growth+rate+of+human+neural+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of neurosphere size on the growth rate of human neural stem/progenitor cells.</a> J Neurosci Res. 84 (8), 1682-1691 (2006).</li>
<li>Kress, C., Vandormael-Pournin, S., Baldacci, P., Cohen-Tannoudji, M., Babinet, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonpermissiveness+for+mouse+embryonic+stem+%28ES%29+cell+derivation+circumvented+by+a+single+backcross+to+129%2FSv+strain%3A+establishment+of+ES+cell+lines+bearing+the+Omd+conditional+lethal+mutation%5BTitle%5D)+AND+%22Mamm+Genome%22%5BJournal%5D)">Nonpermissiveness for mouse embryonic stem (ES) cell derivation circumvented by a single backcross to 129/Sv strain: establishment of ES cell lines bearing the Omd conditional lethal mutation.</a> Mamm Genome. 9 (12), 998-1001 (1998).</li>
<li>Simões-Costa, M., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+neural+crest+identity%3A+a+gene+regulatory+recipe%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Establishing neural crest identity: a gene regulatory recipe.</a> Development. 142 (2), 242-257 (2015).</li>
<li>Memberg, S. P., Hall, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dividing+neuron+precursors+express+neuron-specific+tubulin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dividing neuron precursors express neuron-specific tubulin.</a> J Neurobiol. 27 (1), 26-43 (1995).</li>
<li>Kim, C. N., Shin, D., Wang, A., Nowakowski, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatiotemporal+molecular+dynamics+of+the+developing+human+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Spatiotemporal molecular dynamics of the developing human thalamus.</a> Science. 382, eadf9941(2023).</li>
<li>Grimaldi, A., Comai, G., Mella, S., Tajbakhsh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+bipotent+progenitors+that+give+rise+to+myogenic+and+connective+tissues+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22ELife%22%5BJournal%5D)">Identification of bipotent progenitors that give rise to myogenic and connective tissues in mouse.</a> ELife. 11, e70235(2022).</li>
<li>To, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiomic+atlas+of+human+early+skeletal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A multiomic atlas of human early skeletal development.</a> Nature. 635 (8039), 657-667 (2024).</li>
<li>Bajpai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+stages+of+rapid+and+uniform+neuralization+of+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Molecular stages of rapid and uniform neuralization of human embryonic stem cells.</a> Cell Death Differ. 16 (6), 807-825 (2009).</li>
<li>Kerosuo, L., Nie, S., Bajpai, R., Bronner, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crestospheres%2C+Long-term+maintenance+of+multipotent%2C+premigratory+neural+crest+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Crestospheres, Long-term maintenance of multipotent, premigratory neural crest stem cells.</a> Stem Cell Reports. 5 (4), 499-507 (2015).</li>
<li>Abe, S., Yamaguchi, S., Sato, Y., Harada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphere-derived+multipotent+progenitor+cells+obtained+from+human+oral+mucosa+are+enriched+in+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Sphere-derived multipotent progenitor cells obtained from human oral mucosa are enriched in neural crest cells.</a> Stem Cells Transl Med. 5 (1), 117-128 (2016).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol Neurobiol. 34 (3), 153-161 (2006).</li>
<li>Ziegler, L., Grigoryan, S., Yang, I. H., Thakor, N. V., Goldstein, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+Schwann+cells+from+human+embryonic+stem+cell-derived+neurospheres%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of Schwann cells from human embryonic stem cell-derived neurospheres.</a> Stem Cell Rev Rep. 7 (2), 394-403 (2011).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.22 以上 μ;m シリンジフィルター</td><td>ClearLine</td><td>146560</td><td></td></tr><tr><td>15 mL 高透明度ポリプロピレン コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>200 & マイクロ;L ClearLine Plus 低結合フィルターチップ</td><td>Dutscher</td><td>713263</td><td></td></tr><tr><td>40 & micro;m フィルター</td><td>ファルコン</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>5 mL セロロジカルピペット</td><td>スターシュテット</td><td>86.1253.001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL 高透明度ポリプロピレン コニカルチューブ</td><td>ファルコン</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>アキュターゼ</td><td>メルクシグマ</td><td>A6964</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ フルーア 488 ロバ アンチウサギ IgG (H+L)</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>アレクサ フロー 594 ロバ アンチマウスIgG(H + L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A21203</td><td></td></tr>ア<tr><td>レクサフルーア647ロバ抗ヤギIgG(H + L)</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>抗生物質-抗真菌溶液&nbsp;</td><td>Merck-Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>B27 PLUS supplement</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>ウシ血清アルブミン (BSA)</td><td>Merck-Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Carlo Erba</td><td>438601</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Thermofisher Scientific, Gibco</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6 well clear TC treated multiple well plates</td><td>コーニング</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>カバーグラス、丸型</td><td>VWR</td><td>&nbsp;〒630-2113&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM ノックアウト</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>10829018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12+Glutamax</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>10565018</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>メルクシグマ</td><td>D0822</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind&nbsp;チューブ、2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30108078</td><td></td></tr><tr><td>DNase/RNase-Free 蒸留水</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>10977-035</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco'Thermofisher</td> <td>Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 0.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>ESGRO mLIF Medium Supplement</td><td>Merck-Sigma</td><td>ESG1107</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol 70%</td><td>Carlo Erba</td><td>528170</td><td></td></tr><tr><td>Fetalウシ血清</td><td>メルクシグマ</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>フィブロネクチン</td><td>メルクシグマ</td><td>F085-2MG</td><td></td></tr><tr><td>フルオロマウント-G</td><td>インビトロゲン</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>ゼラチン溶液</td><td>メルクシグマ</td><td>ES-006-B</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィック</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>ヒト EGF</td><td>ペプロテック</td><td>AF-100-15-500UG</td><td></td></tr><tr><td>ヒトFGF-塩基性</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>ヒト SOX9 抗体</td><td>R&Dsystems</td><td>AF3075</td><td></td></tr><tr><td>インスリン 牛膵臓由来</td><td>Merck-Sigma</td><td>I6634</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Biorad</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human AP-2 alpha Monoclonal Antibody, Unconjugated</td><td>DSHB</td><td>3B5</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human PAX7 Monoclonal Antibody, Unconjugated</td><td>DSHB</td><td>PAX7</td><td></td></tr><tr><td>N2 supplement</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィ</td>ック<td>17502048</td><td></td></tr><tr><td>ニューロベースミディアム</td><td>サーモフィッシャーサイエンティフィック</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>非組織培養処理プレート、96ウェル、平底</td><td>ファルコン</td><td>351172</td><td></td></tr><tr><td>非組織培養処理プレート、96ウェル、U底</td><td>ファルコン</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>パラホルムアルデヒド16%溶液、電子</td><td>顕微鏡科学</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Propan-2-ol</td><td>Carlo Erba</td><td>415154</td><td></td></tr><tr><td>精製抗チューブリン &β; 3 (TUJ1) 抗体</td><td>バイオレジェンド</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>ラピクリア 1.47</td><td>スンジンラボ</td><td>RC147001</td><td></td></tr><tr><td>ラピクリア 1.52</td><td>スンジンラボ</td><td>RC152001</td><td></td></tr><tr><td>スコッチ 両面 12.7 mm &times; 22.8 m</td><td></td><td></td><td>クリアファイバーレス両面テープ</td></tr><tr><td>SensiFAST SYBR No-ROX キット</td><td>Meridian Bioscience</td><td>BIO-98020</td><td></td></tr><tr><td>滅菌ディスポーザブル外科用メス</td><td>Swann-Morton</td><td>05XX</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus 接着顕微鏡スライド</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046.AP</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol 試薬</td><td>FisherScientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.05%)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Fisher Scientific</td><td>10113103</td><td></td></tr><tr><td>TWIST1 Rabbit mAb (IF Formulated)</td><td>細胞シグナル伝達技術</td><td>E7E2G</td><td></td></tr><tr><td>&β;-メルカプトエタノール</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td>31350010</tr></tbody></table>

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元 の試験管 外分化のプロトコル

Cranial Neural Crest Cells Three-Dimensional In Vitro Differentiation Protocol for Multiplexed Assay

プロトコールに従って、mESCコロニーを解離し、3000個の細胞を非TC処理U底96ウェルプレートに播種しました。2日目に、凝集したNSを非TC処理された平底96ウェルプレートに移し、付着させました。NS集約プロトコルの簡略化された視覚化を 図1Aに示します。NSを9日目まで培養し、その後免疫蛍光染色のために処理しました。NSからプレート上に移動した細胞をカバースリップに移し、イメージングを行い、CNCC維持培地で13日目まで培養しました。並行して、ペトリ皿でNSを生成するためのプロトコルを、参照および比較ポイントとして実施しました。実験の全体的な目標は、ペトリ皿で実施されたプロトコルで観察されたNS間の変動性を減らすことでした。
TC処理されていない96ウェルプレートで個別に培養した場合、NSは表現型の変動性が減少しました。すべてのNSは5日目に付着し始めますが、付着したNSの割合は非常に変動し、全体として、ペトリ皿で培養した場合、7日目にはそれほど重要ではありませんでした(図1...

With their remarkable capacity to generate both ectodermal and mesenchymal derivatives, cranial neural crest cells (CNCC) have attracted a lot of interest ...

cranial-neural-crest-cells-three-dimensional-vitro-differentiation

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

in vitroで神経堤幹細胞（NCSC）を育成するために、特殊な培地（NCSCM）が必要です。...

マウス神経堤幹細胞の培養のためのニワトリ胚抽出物の製造

神経管から胚の神経堤の分離の使用を容易に...

胎児マウス神経管から神経堤細胞の単離および培養

このビデオは、ニワトリ胚の中脳領域から脳神経襞を分離する技術を示しています。神経襞の詳細な解剖過程、その配置、およびフィブロネクチン被覆ガラスへの付着を示し、続いて神経襞からの神経堤細胞の移動を観察します。...

ニワトリ胚からの頭蓋神経襞の単離による神経堤細胞培養

神経堤ヒト多能性幹細胞に由来する（NC）細胞（HPSC）は、ヒトの発生および疾患をモデル化し、細胞置換療法のための大きな可能性を有する。ここでは、現在広く使用されているのフィーダーフリー適応...

ヒト多能性幹細胞からの神経堤前駆細胞のフィーダーフリー導出

分化したヒト神経幹細胞(hNSC)上のmiRNAの変化を特徴づける目的で、3次元システム上でのhNSC分化、miRNA...

三次元培養、マイクロRNAの分析と推定標的遺伝子上のヒト神経幹細胞株の分化

我々は2人のまたは3次元の胚様体を生成するために、マウスの胚性幹細胞を使用するためのテクニックを説明します。私たちは、その後、レチノイン酸によって胚様体細胞の神経分化を誘導する方法を説明し、どのように前駆細胞マーカーの免疫蛍光およびイムノブロッティングによりそれらの分化の状態を分析します。...

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

このプロトコルは、主に細胞移動の研究のために、マウスモデルからの頭蓋神経堤細胞の解剖および培養について説明する。使用されるライブイメージング技術と速度と細胞形状の変化の解析について述べた。...

神経クレスト細胞の形成と移動の研究のためのマウスからの原発性頭蓋神経クレスト細胞の解剖、培養および分析

ここで提示するプロトコルは、ヒト胚性幹細胞の単細胞培養の生成とその後の神経前駆細胞への分化のためのプロトコルである。プロトコルは、シンプルで堅牢でスケーラブルで、薬物スクリーニングや再生医療用途に適しています。...

ヒト胚性幹細胞の単細胞培養を用いた効率的な神経分化

本プロトコルでは、ヒト多能性幹細胞からの神経節後交感神経ニューロンの生成に対する安定した、高効率な分化戦略を説明する。このモデルは、複数の自律神経障害の研究の使用のためにニューロンを利用可能にします.

フィーダーフリーおよび化学的に定義された培養条件下でのヒト多能性幹細胞を用いた後神経節系交感神経ニューロンの効率的な分化

ここでは、低コストで使いやすい方法を確立し、胚性幹細胞からニューロンへの迅速かつ効率的な分化を導く方法を確立しました。この方法は、研究室間で普及に適しており、神経学的研究のための有用なツールとなり得る。...

インビトロにおけるマウス胚性幹細胞からの神経細胞分化

この汎用性の高いプロトコルは、ニワトリ胚からの脳神経襞の切除による遊走性神経堤細胞(NCC)の単離について説明しています。プレーティングとインキュベーションを行うと、遊走性NCCが神経襞の外植片から出現し、単純化された2D環境での細胞形態と遊走の評価を可能にします。...

ニワトリ頭蓋神経堤細胞培養物の作製と形態解析

学ぶ 頭蓋神経堤細胞の三次元試験管外分化プロトコル。マウス胚性幹細胞を用いて神経球サイズのばらつきを低減し、多重アッセイを可能にする方法です。発生生物学と再生医療の研究に有用です。

多重化の試みのための頭蓋神経堤の細胞の三次元の試験管外分化のプロトコル

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