Name: 体液からの細胞外小胞の特性評価 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: 学ぶテトラスパニンチップを用いた体液由来細胞外小胞の特性評価法。少量の涙などからCD63、CD81、CD9マーカーを蛍光検出し、角膜疾患の非侵襲的バイオマーカー研究に応用できます。

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5 minutes

<table><tbody><tr><td>チップウォッシャー 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>テトラスパニンチップをインキュベート、洗浄、すすぎ、乾燥させます。この現行モデルは現在販売しておりません。購入時の価格: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>ExoView Analyzerソフトウェア</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>チップ情報を分析し、さらに分析するためのExcelファイルを作成します。ご利用いただけなくなりました。</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>テトラスパニンチップを3つの波長でスキャンするために使用されます。この現行モデルは現在販売しておりません。購入時の価格:&nbsp;$110,000.00</td></tr><tr><td>ExoView スキャナーソフトウェア</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>チップを3つの異なる波長でスキャンします。ご利用いただけなくなりました。</td></tr><tr><td>ヒトテトラスパニンキット</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td> 8つの<td>テトラスパニンチップ、インキュベーション溶液、ブロッキング溶液、CD63抗体、CD81抗体、CD9抗体、溶液A、溶液B、USB、プレートカバーが含まれています。</td></tr></tbody></table>

体液からの細胞外小胞の特性評価

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

チップ上のスポットを分析するときは、CD63、CD81、およびCD9チャネルで蛍光標識されたEVを観察してEVの最適な濃度を目指し、図3Aに示すように制御チャネルであるMIgGチャネル30,91を黒のままにする必要があります。CD81は体液のために減少します。CD63、CD81、およびCD9チャネルに蛍光がない場合、EVは存在しません(図3B)。チップが飽和しすぎないように注意してください(図3C)。これにより、分析ソフトウェアがEVのサイズ、総粒子数、および表現型の精度を計算することが困難になります。最適な濃度のスポットから、分析ソフトウェアはEVのサイズ(50-200 nm)、総粒子数、およびテトラスパニン発現を測定でき(図4)、さらに分析するために個々のスプレッドシートにエクスポートされます。テトラスパニン分析には、EV上の表面タンパク質の共局在が含まれます。共局在は "/" で表されます (例: "CD63/CD81")。これは、CD63 と CD81 が組み合わされるという意味ではありません。これは、CD63とCD81の両方がEVの表面に配置されていることを意味します。
これらの結果は、健康なサンプルと病気のサンプルとの間の貴重な洞察を提供します。健康なサンプルと病気のサンプルのどちらがより多くのEVを生成するか、より大きなEVまたはより小さいEVを生成するか、およびEVの表現型を判断できるようになります。これらの特性のいずれかまたはすべてが、疾患の生合成および/または進行に関与している可能性があります。これらの結果により、テトラスパニンレベルが存在しないか増加しているかを確認でき、細胞プロセスとEVの形成に関する洞察を得ることができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
図1:さまざまなEVのタイプとサイズ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
図2:テトラスパニンチップがEVを捕捉して検出する方法の概略図。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
図3:EV濃度の最適化。 (A) EVの最適な濃度。(B)陰性結果:EVは存在しません。(C)EVの過飽和状態。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
図4:ナノ粒子分析装置で生成されたデータ(A)ナノメートルで測定されたEV直径サイズ。(B)EVの総粒子数。(C)EV共局在表現型。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>技術</td>
			<td>利点</td>
			<td>制限</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>超遠心分離機</td>
			<td>高純度42,43</td>
			<td>EVの形態の変化42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>均質性42,45</td>
			<td>大容量が必要42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>機能性42,43</td>
			<td>高価な42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>フローサイトメトリー</td>
			<td>複数の時点におけるサンプルの評価47</td>
			<td>弱い信号48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>複数のエンドポイント47,50</td>
			<td>毛穴の詰まり51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ハイスループットのシングルEV解析52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>密度勾配遠心分離</td>
			<td>高純度のサンプルを作製54</td>
			<td>労働集約型55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>サンプルの種類55,57</td>
			<td>時間のかかる55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>大幅な歩留まり損失54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>降水</td>
			<td>シンプル59,60</td>
			<td>汚染36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>高速61,62</td>
			<td>非特定63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ハイイールド44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>中性pH36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>濾過</td>
			<td>シンプル64 </td>
			<td>トラップエクソソーム65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>ファスト64</td>
			<td>大きな小胞を損傷する36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>安価な64</td>
			<td>フィルターケーキ66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>エキソソームの詰まり65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1:EVアイソレーション技術の利点と制限。 EVを分離するさまざまな方法(その利点と制限を含む)のリスト。
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>技術</td>
			<td>利点</td>
			<td>制限</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>動的光散乱</td>
			<td>サイズ1 nmから6 μMの範囲の粒子を測定します78 </td>
			<td>大きなサイズ範囲の複雑なエキソソームサンプルの測定には適していません79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>下限は10nmで、単分散システムに適しています79 </td>
			<td>汚染されたタンパク質とエキソソームを区別できない79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>透過型電子顕微鏡(TEM)</td>
			<td>エクソソームの形態を観察する79,80 </td>
			<td>複雑なサンプル調製79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>内部構造81の観察 </td>
			<td>蛍光シグナルが誇張されているため、サイズと形状に基づいてエクソソームを区別できない82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ナノ粒子追跡分析</td>
			<td>10 nmから2 μMの範囲でのエキソソームの濃度、サイズ、およびサイズ分布を測定する78 </td>
			<td>EVをタンパク質凝集体や他の汚染物質と区別できない83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>迅速なサンプル調製と測定78,84</td>
			<td>高価なNTA機器85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>サンプルはネイティブフォーム84で回収可能 </td>
			<td>振動に敏感85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ウェスタンブロット(WB)</td>
			<td>マーカータンパク質を定性的・定量的に解析できる79,86 </td>
			<td>複雑で時間がかかる79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>細胞培養培地からのエクソソームの分析79 </td>
			<td>EV分離株は、リポタンパク質および他の汚染物質を含んでいてもよい86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">フローサイトメトリー</td>
			<td>より高い感度と高解像度のイメージング</td>
			<td rowspan="2">400 nmの検出限界で時間と手間がかかります79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>染色されたエクソソームと封じ込めを区別する87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>必要な低サンプル濃度79 </td>
			<td>光信号は精度と解像度88を妨げます </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>エグゾビュー</td>
			<td>エクソソーム上のテトラスパニン(CD9、CD63、およびCD81)を測定する89 </td>
			<td>より大きなEVサイズを測定しません75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>EVカーゴタンパク質を測定90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表2:EV特性評価手法の利点と制限。

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

細胞外小胞は、生理学的状態を反映する疾患のバイオマーカーとして機能します。私たちのアプローチは、微量の涙液から豊富なデータを抽出することを可能にし、体液のEV研究を前進させます。実験上の主な課題には、小さなサンプルから十分な細胞外小胞濃度を得ること、単離中のサンプル損失を最小限に抑えること、チップの過飽和やシグナルの弱さを検出するための分析の最適化などがあります。このプロトコルは、単離ステップを回避し、処理時間を短縮し、少量のサンプルから細胞外小胞を分析できるため、涙液などの限られた生物学的サンプルに最適です。非侵襲的バイオマーカーは、角膜疾患の早期発見と管理に不可欠です。細胞外小胞バイオマーカーは、疾患のモニタリング、個別化治療、患者のコンプライアンスの向上、生活の質の向上を可能にします。私たちの研究室は、KC被験者の涙液サンプル中の細胞外小胞の分析を開拓し、ユニークなtEVシグネチャを特定しました。これにより、将来の診断薬やEVに焦点を当てた治療標的への道が開かれます。まず、生物学的サンプルとテトラスパニンチップをワークスペースに置きます。ヒトテトラスパニンキットの溶液Bと事前に混合された70マイクロリットルのヒト生物学的サンプルをチップにピペットで移します。フィルムをチップ洗浄プレートに置き、サンプルの蒸発を防ぎます。16時間後、プレートをチップワッシャーに入れます。所定の位置にロックし、蓋を閉めます。チップワッシャーのCW-TETRA v0オプションを押します。チップを洗浄している間に、チップあたり300マイクロリットルのブロッキング溶液を準備します。チップあたり各抗体0.6マイクロリットルをブロッキング溶液に加えます。ブロッキング溶液を抗体カクテルでボルテックスし、完全に混合します。チップの洗浄が完了したら、各チップの上に抗体カクテルを載せたブロッキング溶液を250マイクロリットル加えます。次に、蓋を閉じて[続行]を押します。チップワッシャーが鳴ったら、チップウォッシングプレートを取り外します。チップをスロープの上に移動します。プレートをチップワッシャーに戻し、所定の位置にしっかりとロックされていることを確認します。蓋を閉じて、続行を押します。まず、ナノ粒子分析装置の電源を入れます。ナノ粒子分析装置に接続されたデスクトップでスキャンソフトウェアプログラムを起動します。チップフォルダを選択して各テトラスパニンチップを選択し、チャックのチップ位置に配置します。[チップ位置]の下の3つの正方形をクリックして、蛍光をオンにします。正方形が黄色、青、赤に変わります。チャックの蓋を押して引っ張り、取り外します。次に、サンプルをロードしたテトラスパニンチップをチャックにしっかりと固定します。チャックリッドのペグを穴に合わせ、押し下げます。蓋をスライドさせて所定の位置にロックします。次に、チャックをステージに置き、所定の位置にロックします。次に、ソフトウェアインターフェースから[スキャンチップ]をクリックし、[OK]をクリックします。ステージが機械に完全に移動したら、ドアを閉めます。スキャンが完了したら、ドアを開けてステージを取り出し、結果を確認します。スキャンが成功した場合は、チップを廃棄します。次のチップセットをチャックに置きます。または、空のチャックをステージに戻します。ソフトウェアを終了し、終了したらマシンの電源を切ります。CD63、CD81、およびCD9チャネルでは細胞外小胞の最適な蛍光レベルが観察されましたが、MIgG制御チャネルは黒のままであり、制御特異性が確認されました。CD81は体液のために減少しました。CD63、CD81、およびCD9チャネルの蛍光は、細胞外小胞の不在を示しています。蛍光の過飽和は明らかであり、特にCD63、CD81、およびCD9チャネルにおける過剰な標識のために意味のあるデータを識別することが困難でした。

characterizing-extracellular-vesicles-from-biological-fluids

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

血液中に存在する細胞外小胞は、さまざまな疾患の新規バイオマーカーとして提案されています。ここでは、末梢血サンプルから大きな原形質膜由来の微小胞を単離し、その後の従来のフローサイトメトリーとウェスタンブロッティングによる分析のためのプロトコルを紹介します。...

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