ヒト腸オルガノイドの神経支配
January 17th, 2025
ヒト腸オルガノイドは、天然のヒト腸の構造と機能をよりよく再現するために神経支配されなければなりません。ここでは、これらの構築物に腸神経系を組み込むための1つの方法を紹介します。
私たちの研究は、短腸症候群の解決策として組織改変された腸の生成に焦点を当てています。私たちの研究室では、腸神経系の統合を最適化し、空間組織、細胞の多様性、および機能を最適化することに焦点を当てています。いつの日か、腸の失敗に苦しむ子供たちのために、バイオエンジニアリングされた腸を作ることで人生を変える解決策を生み出すことができることを願っています。
ヒトの腸内オルガノイドを神経支配するには、ヒトの腸の発達を模倣する必要がありますが、これは困難な場合があります。腸管神経系の発達には、生化学的シグナル伝達と生体力学的力の両方が必要です。私たちの研究室の将来の研究は、ヒト腸オルガノイド内の腸神経系の発達を最適化することに焦点を当てています。
私たちは空間的組織と細胞の多様性を研究しており、最近では、腸内オルガノイド内のENSを堅牢に特徴付け、定量化できるヘラス博士が開発した新しい3Dイメージング技術を使用しています。これは、モデルを改良し、人間の腸の発達と機能を再現するのに役立ちます。まず、15日目から21日目のプレートで培養した腸管神経堤細胞またはENCCスフェロイドを取り、ウェルから培地を慎重に取り出します。
1ミリリットルの温かい酵素細胞剥離試薬をウェルに加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、プレートの側面をタップして、スフェロイドの解離を促進します。先端が広口のP1000マイクロピペットを使用して、細胞が均一になるまでピペッティングで穏やかに上下させて混合物を滴定します。
ENCCサスペンションを15ミリリットルの円錐管に移します。1ミリリットルの温かい神経堤細胞培地でウェルを洗浄して残りの細胞を採取し、これを円錐管に加えます。次に、細胞懸濁液を300 Gで1分間遠心分離します。
次に、滅菌ピペットチップを使用して上清を吸引します。その後、広口ピペットチップを使用して、細胞ペレットを1ミリリットルの温かい神経堤細胞培地に再懸濁します。広口ピペットチップを使用して、ヒト腸オルガノイドプレートのすべてのウェルから培養した中腸後腸スフェロイドを採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。
計算された量のENCC懸濁液を、中後腸スフェロイドを含む円錐管に加えます。広口ピペットチップを使用して、混合物を穏やかにトライテートし、スフェロイドとENCCを均一に混合します。結合した細胞懸濁液を300 Gで1分間遠心分離します。
滅菌ピペットチップを使用して上清を慎重に吸引します。次に、得られた細胞ペレットを、フェノールを含まない低温成長因子還元基底膜マトリックスに再懸濁します。次に、透明な基底膜マトリックスに再懸濁された中後腸スフェロイドとENCCの30マイクロリットルの液滴を各ドライウェルの中心にピペットで移します。
すべての液滴がメッキされたら、プレートを覆い、反転させ、5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。0日目に、透明な基底膜マトリックスが重合したら、各液滴を500マイクロリットルの暖かい0日目から3つのHIO培地で覆います。3日目に、0日目から3日目のHIO培地を、透明な基底膜マトリックス液滴を乱さずに、各ウェルの側面から慎重に吸引します。
500マイクロリットルの温かい3日目から14日目のHIO培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。14日目に、顕微鏡で各ウェルを検査し、透明な3D基底膜マトリックスの各液滴で発生しているHIO + ENS構造の数を評価します。30マイクロリットルの透明な基底膜マトリックスを2ミリリットルの微量遠心チューブに加え、氷上に保ちます。
層流フードの下で、細い鉗子を使用して、懸濁したHIO+ENSを含む透明な3D基底膜マトリックス液滴を慎重に除去します。鉗子を使用して、個々のHIO + ENS構造をそっと引き離します。細い鉗子または広口ピペットチップを使用して、分離された各HIO+ENS構造を、30マイクロリットルの透明な基底膜マトリックスが入ったマイクロ遠心チューブに入れます。
次に、再懸濁したHIO+ENSの30マイクロリットルの液滴を透明な基底膜マトリックスにピペットで移し、各ドライウェルの中央に注入します。液滴が重合したら、500マイクロリットルの温かい新鮮な3日目から14個のHIO+ENS培地を各ウェルに加え、プレートを一晩インキュベートします。15日目に、重合液滴を乱さずに、各ウェルの側面から3日目から14日目の培地を慎重に吸引します。
メディアを500マイクロリットルの暖かい日15〜28 HIO + ENSメディアと交換します。HIO-ENS共培養は、間葉系構造の発達とともに有意な成長を示し、薄くて霞んだ突起を形成し、30日目までに上皮退縮の周りにハロー状の境界を作り出しました。ENCCはHIOに向かって移動し、間葉内に統合され、HIO内のGFP蛍光で示されるようにin vitroで生存し、間葉からの適切な生存と分化シグナルを確認しました。
移植したHIO+ENS共培養では、in vivo増殖後にHuCDなどの神経細胞マーカーとS100βなどのグリアマーカーが発現し、神経細胞とグリアの両方への分化が確認されました。
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概要
この研究は、短腸症候群に対処するための組織工学的腸の生成に焦点を当てています。人間の腸オルガノイドに腸神経系を統合することの重要性を強調し、より自然な腸機能を模倣することを目的としています。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- バイオテクノロジー
- 組織工学
背景
- 短腸症候群は小児医療において重大な課題をもたらします。
- 人間の腸オルガノイドは腸の発生を研究する上で重要です。
- 神経支配はオルガノイドの機能性にとって重要です。
- 腸神経系の発達には複雑なシグナル伝達と機械的力が関与しています。
研究目的
- オルガノイドにおける腸神経系の統合を最適化する。
- 工学的腸における空間的組織と細胞の多様性を向上させる。
- 腸機能不全の子供たちのための解決策を開発する。
使用された方法
- 人間の腸オルガノイドの生成。
- 生化学的シグナル伝達経路の組み込み。
- 発生を模倣するための生物力学的力の適用。
- オルガノイド内での細胞間相互作用の最適化。
主な結果
- 腸神経系構成要素の成功的な統合。
- 工学的腸組織の機能性向上。
- 自然な腸構造のより良い模倣。
- 腸オルガノイド発達に関する将来の研究の基礎。
結論
- 神経支配されたオルガノイドは組織工学における重要な進歩を表しています。
- 臨床応用のために継続的な研究が必要です。
- この研究は腸機能不全の潜在的な治療法の基礎を築いています。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Integrating the enteric nervous system (ENS) into human intestinal organoids addresses a critical gap in modeling intestinal physiology for translational research and preclinical development. This capability enhances predictive confidence in disease modeling and supports mechanistic de-risking for gastrointestinal drug discovery. The approach enables more physiologically relevant systems for early-stage target validation and functional screening in biopharma R&D portfolios.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Supports interrogation of ENS-dependent pathways in intestinal biology.
- Enables functional target validation in a human-relevant 3D system.
- Facilitates mechanistic de-risking by recapitulating neural-epithelial interactions.
- Improves predictive confidence for early-stage asset triage.
Screening & Assay Development
- Provides a validated platform for quantitative assessment of ENS integration.
- Enables reproducible co-culture conditions for compound screening.
- Supports standardization of 3D organoid assays for neural function.
- Allows for scalable preparation of innervated organoids for downstream workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling of intestinal motility and function.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation of ENS-targeted therapies.
- Supports risk-adjusted advancement decisions for gastrointestinal indications.
- Provides a platform for biomarker discovery linked to ENS maturation.
Pipeline & Workflow Integration
This method positions innervated human intestinal organoids as a bridge from early discovery to preclinical validation in gastrointestinal research pipelines.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing of ENS contributions to intestinal development and function.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for neural integration and organoid maturation.
- Analytics: Supports robust imaging and marker-based quantification of ENS components.
- Translational Research: Facilitates alignment with disease models requiring functional ENS.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse gastrointestinal R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in intestinal models.
- Operational Value: Standardizes ENS integration and supports scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk for GI assets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ENS-targeted and GI therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in stem cell differentiation and 3D co-culture systems.
- Demands access to advanced imaging and marker quantification infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization of differentiation and co-culture protocols.
- May require adaptation for different organoid or ENS progenitor sources.
- Dependent on robust in vitro and in vivo validation of ENS integration.
