Name: ヒト腸オルガノイドの神経支配 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶヒト腸オルガノイドへの神経支配統合の最適化手法。生化学シグナルと生体力学的力を用いて、腸不全児の治療に向けた組織工学の進歩を実現する技術を習得する。

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<ol><li>Wales, P. W., Christison-Lagay, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+bowel+syndrome%3A+epidemiology+and+etiology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Short bowel syndrome: epidemiology and etiology.</a> Semin Pediatr Surg. 19 (1), 3-9 (2010).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>100x 非必須アミノ酸溶液 (NEAA)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL コニカルチューブ</td><td>Thermo Scientific</td><td>12565269</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>07920</td> <td>"酵素細胞剥離試薬"</td></tr> <tr><td>B-27 サプリメント (50x)、ビタミン A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12587010</td><td>ENCC用</td></tr><tr><td>B-27 サプリメント (50x)、無血清</td><td>Gibco</td><td>17504044</td><td>HIO</td></tr><tr><td>Bright-Line 血球計算計</td><td>用 Hausser Scientific</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar 超低アタッチメント マイクロプレート</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-601</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 24-well, TC treated</td><td>VWR</td><td>29442-044</td><td></td></tr><tr><td>Corning Flat-Bottom Plate 3516 6 well</td><td>VWR</td><td>29442-042</td><td></td></tr><tr><td>Essential 6 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A1516401</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8 Media</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2858501</td><td>代替幹細胞培地、ENCCプレートに使用。&nbsp;</td></tr><tr><td>細目鉗子</td><td>デュモン</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle i160</td><td>Thermo Scientific</td><td>50145522</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Advanced DMEM/F12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Gibco HEPES 1 M</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Neurobasal Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>グルタグロ、200 mM、100x</td><td>コーニング</td><td>25-015-CI</td><td></td></tr><tr><td>グルタマックス</td><td>サーモフィッシャー サイエンティフィ</td>ック <td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>H9 ヒト ESC</td><td>ウィセル インターナショナル幹細胞バンク</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HyCloneTM FBS 定義</td><td>VWR</td><td>16777-002</td><td></td></tr><tr><td>LabGard 生物学的安全キャビネット</td><td>Nuaire</td><td>Nu-430-400</td><td></td></tr><tr><td>マトリゲルGFR基底膜マトリックス、フェノールレッドフリー、LDEVフリーコー</td><td>ニング</td><td>356231</td><td>"クリア3D基底膜マトリックス"</td></tr><tr><td>マトリゲルhESC認定マトリックス、LDEVフリー</td><td>コーニング</td><td>354277</td><td>"3D基底膜マトリックス"</td></tr><tr><td>マイクロピペットエ</td><td>ッペンドルフ(100-1000、20-200、10-100、2-20、0.5-10、0.1-2.5 uL)</td><td>2231300008</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR 1</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>85850</td><td>"幹細胞培地" カタログ番号には、事前に一括で追加される5倍サプリメントが含まれています。&nbsp;</td></tr><tr><td>N-2 Supplement (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502048の HIO</td><td></td></tr><tr><td>用 N-2 Supplement, CTS (Cell Therapy Systems)</td><td>Thermo Fisher</td><td>A1370701</td><td>For ENCC.少し異なる処方。</td></tr><tr><td>Nikon DS-Fi2 TS-100 顕微鏡</td><td>Nikon</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Noggin-conditioned media</td><td>Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human Activin A</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>GFH6-100</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒト BMP-4</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>314BP010</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトEGFタンパク質、CF</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>236-EG-200</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGFベーシック/FGF2 (146 aa) プロテイン・</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィ</td>ック <td>233-FB-010</td><td></td></tr><tr><td>組換えヒトFGF-4</td><td>Peprotech</td><td>100-31</td><td></td></tr><tr><td>ReLeSR</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5872</td><td>「幹細胞解離試薬」</td></tr><tr><td>レチノイン酸</td><td>SIGMA</td><td>R2625-50MG</td><td></td></tr><tr><td>Rnase-free Microfuge tubes, 2 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12425</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>R-Spondin Conditioned media</td><td>Texas Medical Center Digestive Disease Center GEMS Core, Enteroid/Organoid Sub-core</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542、Tocris Bioscience</td><td>フィッシャーサイエンティフィック</td><td>16-141-0</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R 遠心分離機</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>スタンダード ワイドオリフィス ピペットチップ</td><td>VWR</td><td>89049-166</td><td></td></tr><tr><td>Stemolecule Chir99021 溶液</td><td>中 Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td></td></tr><tr><td>滅菌フィルターピペットチップ</td><td>VWR (1000uL、200uL、10uL)</td><td>76322-154、76322-150、89174-520</td><td></td></tr><tr><td>ビトロネクチンXF</td><td>幹細胞技術</td><td>7180</td><td>ENCCプレートに使用される代替3D基底膜マトリックス。&nbsp;</td></tr></tbody></table>

ヒト腸オルガノイドの神経支配

Innervation of Human Intestinal Organoids

ENSは、蠕動運動、栄養吸収、体液輸送、上皮バリアの維持など、成熟した小腸の本質的な機能を調節します。したがって、HIOを神経支配する目標は、これらのコンストラクトに、より成熟した高レベルの機能を開発するために必要な要素を提供することです。この目的のために、私たちの研究室では、HIO内のENSの発達と、さまざまな段階での機能的結果を特に研究しています。
細胞の成長、分化、形態形成を経時的にモニタリングし、各ステップが期待どおりに進行していることを確認することで、次のステージに進むことが重要です。ENCCの分化とスフェロイド形成は最大3週間の期間にわたって行われ、 図2に示すように、分化後およびENCCスフェロイド形成のさまざまな段階でのENCCの代表的な明視野顕微鏡写真が示されています。ENCCは、12日目までに細胞単層内で目に見える凝集体を形成し始め、その後、超低接着プレートに再プレーティングした後、自発的にスフェロイドが形成されるはずです。ENCCスフェロイドはこの段階で急速に成長する傾向があり、肉眼で容易に見ることが...

The complexity of intestinal cytoarchitecture and function poses significant challenges for the creation of the bioengineered small intestine. Techniques ...

私たちの研究は、短腸症候群の解決策として組織改変された腸の生成に焦点を当てています。私たちの研究室では、腸神経系の統合を最適化し、空間組織、細胞の多様性、および機能を最適化することに焦点を当てています。いつの日か、腸の失敗に苦しむ子供たちのために、バイオエンジニアリングされた腸を作ることで人生を変える解決策を生み出すことができることを願っています。ヒトの腸内オルガノイドを神経支配するには、ヒトの腸の発達を模倣する必要がありますが、これは困難な場合があります。腸管神経系の発達には、生化学的シグナル伝達と生体力学的力の両方が必要です。私たちの研究室の将来の研究は、ヒト腸オルガノイド内の腸神経系の発達を最適化することに焦点を当てています。私たちは空間的組織と細胞の多様性を研究しており、最近では、腸内オルガノイド内のENSを堅牢に特徴付け、定量化できるヘラス博士が開発した新しい3Dイメージング技術を使用しています。これは、モデルを改良し、人間の腸の発達と機能を再現するのに役立ちます。まず、15日目から21日目のプレートで培養した腸管神経堤細胞またはENCCスフェロイドを取り、ウェルから培地を慎重に取り出します。1ミリリットルの温かい酵素細胞剥離試薬をウェルに加え、摂氏37度で30分間インキュベートします。次に、プレートの側面をタップして、スフェロイドの解離を促進します。先端が広口のP1000マイクロピペットを使用して、細胞が均一になるまでピペッティングで穏やかに上下させて混合物を滴定します。ENCCサスペンションを15ミリリットルの円錐管に移します。1ミリリットルの温かい神経堤細胞培地でウェルを洗浄して残りの細胞を採取し、これを円錐管に加えます。次に、細胞懸濁液を300 Gで1分間遠心分離します。次に、滅菌ピペットチップを使用して上清を吸引します。その後、広口ピペットチップを使用して、細胞ペレットを1ミリリットルの温かい神経堤細胞培地に再懸濁します。広口ピペットチップを使用して、ヒト腸オルガノイドプレートのすべてのウェルから培養した中腸後腸スフェロイドを採取し、15ミリリットルの円錐管に移します。計算された量のENCC懸濁液を、中後腸スフェロイドを含む円錐管に加えます。広口ピペットチップを使用して、混合物を穏やかにトライテートし、スフェロイドとENCCを均一に混合します。結合した細胞懸濁液を300 Gで1分間遠心分離します。滅菌ピペットチップを使用して上清を慎重に吸引します。次に、得られた細胞ペレットを、フェノールを含まない低温成長因子還元基底膜マトリックスに再懸濁します。次に、透明な基底膜マトリックスに再懸濁された中後腸スフェロイドとENCCの30マイクロリットルの液滴を各ドライウェルの中心にピペットで移します。すべての液滴がメッキされたら、プレートを覆い、反転させ、5%二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターに30分間置きます。0日目に、透明な基底膜マトリックスが重合したら、各液滴を500マイクロリットルの暖かい0日目から3つのHIO培地で覆います。3日目に、0日目から3日目のHIO培地を、透明な基底膜マトリックス液滴を乱さずに、各ウェルの側面から慎重に吸引します。500マイクロリットルの温かい3日目から14日目のHIO培地と交換し、プレートをインキュベーターに戻します。14日目に、顕微鏡で各ウェルを検査し、透明な3D基底膜マトリックスの各液滴で発生しているHIO + ENS構造の数を評価します。30マイクロリットルの透明な基底膜マトリックスを2ミリリットルの微量遠心チューブに加え、氷上に保ちます。層流フードの下で、細い鉗子を使用して、懸濁したHIO+ENSを含む透明な3D基底膜マトリックス液滴を慎重に除去します。鉗子を使用して、個々のHIO + ENS構造をそっと引き離します。細い鉗子または広口ピペットチップを使用して、分離された各HIO+ENS構造を、30マイクロリットルの透明な基底膜マトリックスが入ったマイクロ遠心チューブに入れます。次に、再懸濁したHIO+ENSの30マイクロリットルの液滴を透明な基底膜マトリックスにピペットで移し、各ドライウェルの中央に注入します。液滴が重合したら、500マイクロリットルの温かい新鮮な3日目から14個のHIO+ENS培地を各ウェルに加え、プレートを一晩インキュベートします。15日目に、重合液滴を乱さずに、各ウェルの側面から3日目から14日目の培地を慎重に吸引します。メディアを500マイクロリットルの暖かい日15〜28 HIO + ENSメディアと交換します。HIO-ENS共培養は、間葉系構造の発達とともに有意な成長を示し、薄くて霞んだ突起を形成し、30日目までに上皮退縮の周りにハロー状の境界を作り出しました。ENCCはHIOに向かって移動し、間葉内に統合され、HIO内のGFP蛍光で示されるようにin vitroで生存し、間葉からの適切な生存と分化シグナルを確認しました。移植したHIO+ENS共培養では、in vivo増殖後にHuCDなどの神経細胞マーカーとS100βなどのグリアマーカーが発現し、神経細胞とグリアの両方への分化が確認されました。

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

発生生物学

このビデオでは、まずヒトが誘導した多能性幹細胞を特殊な培地で培養してスフェロイドを形成し、次に特定の阻害剤を用いて運動ニューロンに分化させ、最後にマイクロ流体チップで培養して軸索を延長し、運動神経オルガノイドを形成するという運動神経オルガノイドの作り方を実演しています。...

マイクロ流体チップを用いたヒトiPS細胞由来運動神経オルガノイドの開発

このプロトコルは腸のオルガノイドに人間の多能性セルの微分を可能にする。プロトコルは決定的な内胚葉、hindgutの内胚葉および次に腸の上皮の人口にセルを分化することによって正常な人間の開発をまねる。これにより、このプロトコルは、腸の発達と疾患モデリングアプリケーションの両方の研究に適しています。...

iPS細胞由来腸オルガノイドの作製による発生・疾患モデリングへの応用

ここでは、腸管固有の相互作用のモデリングを可能にする2つのプロトコルを提示する。オルガノイド由来の腸単層および空気液体界面(ALI)培養は、光とバソララルの両方からアクセス可能な十分に分化された上皮の生成を促進する一方で、極性逆腸器官は彼らの極性側を露出させ、高スループットアッセイに適している。...

腸オルガノイドモデルを用いたアプリカル特異的相互作用を研究する培養法

ここでは、ヒト多能性幹細胞由来の小腸オルガノイドおよび結腸オルガノイドを作製、維持、および特性評価するための詳細な方法について説明します。これらの方法は、オルガノイドのプレーティングと継代に必要な作業時間を短縮し、再現性を向上させ、スケーラビリティを拡大するように設計されています。...

ヒト多能性幹細胞由来腸管オルガノイドおよび結腸オルガノイドの作製、維持、および特性評価

このプロトコルは、マウス小腸オルガノイドの樹立、マウス小腸固有層からの1型先天性リンパ系細胞の単離、および腸上皮細胞と1型先天性リンパ系細胞との間の双方向相互作用を研究するための両方の細胞型間の3次元(3D)共培養を確立するための詳細な指示を提供する。...

マウス小腸上皮オルガノイドと先天性リンパ球細胞との共培養

生検由来の腸オルガノイドと臓器オンチップ技術は、領域特異的な腸機能を再要約するためにミクロ生理学的プラットフォームに組み合わされます。...

ヒトオルガノイドと臓器オンチップ技術を組み合わせて腸領域特異的機能をモデル化

ここでは、ラット腸管オルガノイドを作製し、いくつかのダウンストリームアプリケーションで使用するためのプロトコルを紹介します。ラットはしばしば好ましい前臨床モデルであり、堅牢な腸オルガノイド系は、in vivo研究に付随するin...

ラット腸管オルガノイドの作製と操作

このプロトコルは、ヒト腸オルガノイド技術とシングルセルトランスクリプトーム解析を組み合わせて、これまで未踏の腸内生物学に関する重要な洞察を提供します。...

ヒト腸オルガノイドを使用して、単一細胞転写レベルでの小腸上皮の理解

この研究では、小腸と大腸に由来するブタオルガノイドの2D単層を生成するためのプロトコルを概説しています。これらの単層の成長は、TEER値の増加によって特徴付けられ、堅牢な上皮の完全性を示します。さらに、これらの単分子膜は、フォルスコリンの適用後のUssingチャンバー実験で生理学的分泌応答を示します。...

天然腸の生理学的特性を反映した二次元ブタ腸管オルガノイド

神経上皮組織の前例のない複雑さのために、人間の脳の発達をモデル化することが妨げられてきました。ここでは、ヒトの脳発生の初期のイベントを明らかにし、in...

初期の神経発達障害をモデル化するためのiPSC由来のヒト脳オルガノイドの生成

学ぶヒト腸オルガノイドへの神経支配統合の最適化手法。生化学シグナルと生体力学的力を用いて、腸不全児の治療に向けた組織工学の進歩を実現する技術を習得する。

ヒト腸オルガノイドの神経支配

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