沿岸湿地におけるメタン循環微生物動態の可視化

この研究は、テキサス州南部の沿岸湿地における主要なメタン循環微生物遺伝子の空間的および時間的分布を視覚的に一致させ、環境要因がメタンダイナミクスをどのように調節するかを調査しました。私たちの調査結果は、テキサス州南部の沿岸湿地における豊富なメタン循環遺伝子が、塩分濃度や季節などの環境条件に敏感であることを示しています。特に、メタンモノオキシゲナーゼ遺伝子の一種であるmmoXは、涼しい季節に最も豊富です。

このプロトコルは、環境要因の影響を受ける空間的および季節的な微生物ダイナミクスを視覚化するための新しいツールを提供することにより、メタン循環微生物遺伝子の検出研究に取り組みます。最適化されたPCR法とGISの可視化を統合することにより、このプロトコルは、環境要因の影響を受ける動的、空間的、季節的な微生物パターンをキャプチャしながら、メタン循環遺伝子の検出と空間マッピングを強化します。

[ナレーター]まず、eDNAおよびその他の成分を含む25マイクロリットルのcPCR反応混合物を調製します。チューブをPCR装置に入れ、適切なパラメータでcPCR反応を実行します。cPCR後、テンプレートDNAを除くサイバーグリーンを含むqPCR反応混合物を調製します。調製した反応混合物57マイクロリットルを各PCRチューブに分注します。3マイクロリットルのテンプレートDNA、標準水またはヌクレアーゼフリー水を各チューブに加え、チューブを軽くたたいて混合します。調製した反応混合物20マイクロリットルを各チューブから96ウェルqPCRプレートの指定されたウェルに分注します。アプリケーターを使用して、PCRプレートを粘着性PCRシールフィルムでシールします。そして、1,000 x g で 1 分間遠心分離して、適切な混合を確保し、ウェル内の気泡を除去します。PCRプレートをサーマルサイクラーに入れます。qPCRマシンの電源を入れ、関連ソフトウェアを開いてプロトコルを設定します。qPCRプログラムをセットアップし、実行を開始します。地理情報システム ソフトウェア ArcGIS Pro を開き、コンピューター上の指定したフォルダーに Study Area という名前のプロジェクト ファイルを保存します。[マップ] をクリックし、[ベースマップ] を選択し、ベースマップとしてラベル付きの地形を選択します。「検索」をクリックし、「検索」をクリックします。検索バーが開いたら、分析範囲の名前を入力して、マップ上で検索します。地理参照を使用して特定の領域を描画するには、最上位レイヤーから [表示] をクリックし、次に [カタログ ペイン] をクリックします。カタログからフォルダーをダブルクリックし、必要なファイル名を選択します。geo データベース .gdb ファイルを右クリックします。[新規] をクリックし、[フィーチャクラス] を選択します。次に、[フィーチャクラスの作成]ウィンドウが表示されます。[名前とエイリアス] ボックスを入力し、下部にある [完了] をクリックします。次に、「表示」をクリックし、続いて「コンテンツ」をクリックします。エイリアス名が [コンテンツ] ウィンドウに表示されます。最上層から [編集] をクリックし、続いて [作成] をクリックします。[フィーチャの作成] ウィンドウが開きます。[フィーチャの作成] ペインでエイリアスをダブルクリックすると、[ツール フィードバックの構成] オプションが表示されます。線分を選択し、マップ上に線分をスケッチして、分析範囲の境界を作成します。マップをダブルクリックして終了します。GIS ソフトウェアを最小化し、スプレッドシートを開きます。最初の列にサンプル名を入力し、2 番目の列に緯度を入力し、3 番目の列に経度を入力します。pmoA1、pmoA2、mmoX、およびmcrAのqPCRデータには、次の4つの列を使用します。ファイルを CSV 形式でコンピューター上の特定のフォルダーに保存します。次に、GIS ソフトウェアを開き、[データの追加]、[XY ポイント データ] の順にクリックします。[入力テーブル]ボックスのフォルダーから保存したCSVファイルを選択します。[出力フィーチャクラス] ボックスでファイルの名前を変更し、[実行] をクリックして、サンプリング ポイントをマップ上に表示します。次に、上部の検索バーをクリックして、Krigingを検索します。サンプリングステーションファイルを選択し、pmoA1を選択します。次に、環境をクリックし、レイヤーとマスクでサンプリングステーションを選択して、[実行]をクリックします。マップのレイアウトを作成するには、[挿入]、[新しいレイアウト] の順にクリックし、[ANSI-Landscape] を選択します。[マップフレーム]をクリックし、クリギングでマップを選択し、長方形を描画してレイアウトにすべてのマップを配置します。[方位記号]を選択し、レイアウトに配置して北の方向を示します。次に、[縮尺記号] を選択して、マップ上にエリアの縮尺を表示します。[凡例] をクリックし、レイアウトに配置してマップの凡例を表示します。[グリッド]をクリックし、黒い経緯線オプションを選択して、緯度と経度のグリッドを作成します。グリッドが [コンテンツ] ウィンドウに [Black Horizontal Label Graticule] というラベルで表示されます。Black Horizontal Label Graticuleをダブルクリックし、Componentsを選択し、右側の十字記号をクリックしてTicks 1とGridを削除します。最後に、最上層から [共有] をクリックし、[レイアウトのエクスポート] をクリックします。ファイル タイプを PDF として選択し、[名前] ボックスを使用してファイルをコンピューターに保存し、垂直解像度を 500 DPI に設定して [エクスポート] をクリックしてマップの PDF ファイルを作成します。 cPCR分析により、メタンサイクリング関連遺伝子検出の空間的変動が明らかになり、mcrA遺伝子はすべてのLBおよびRVサンプルで検出されましたが、BCサンプルには存在せず、塩分濃度とメタン生成菌の分布が関連付けられました。cPCRは、A189-mb661プライマーペアを含むpmoA1の明るいバンドを示し、RVサンプルでは低いが検出可能な存在量を確認しましたが、LBとBCには存在しませんでした。qPCR分析では、mmoX遺伝子は涼しい季節に最も豊富で、pmoA1は暖かい季節に最も豊富で、高い季節変動が示されました。