生理学的管腔内圧下での小さな肺静脈におけるCa2⁺ シグナルのイメージング

このプロトコルでは、生理学的管腔内圧で肺内静脈(小肺静脈またはPV)のCa²⁺ シグナルを記録および分析するための新しい技術を紹介します。この手法には、小さなPVの単離、Ca²⁺ インジケーターによるインキュベート、カニューレ挿入と加圧、Ca²⁺ シグナルの共焦点イメージング、およびデータ解析が含まれます。

カルシウムシグナルは血管機能を調節しますが、その発生源と役割はさまざまです。血管壁における特異的な機能を理解し、疾患に関連する異常を特定することを目指しています。ほとんどの肺血管研究は、肺静脈ではなく、動脈や毛細血管に焦点を当てています。

生理学的関連性にもかかわらず、正常な管腔内圧下での肺静脈のカルシウムシグナルを調べた研究はありません。肺静脈は心周期中に圧力変化を受けますが、カルシウム信号への影響は研究されていませんでした。当社のプロトコルは、常圧での小さな肺静脈のカルシウムシグナルの取得と自動分析を可能にします。

私たちのプロトコルは、管腔内圧が小さな肺静脈のカルシウム信号にどのように影響するかについての将来の研究を可能にし、健康と疾患におけるそれらの調節と役割の理解を促進します。まず、解剖ツールと皿を100%エタノールで洗浄し、脱イオン水で洗います。ハサミで。

安楽死させたマウスの胸腔を開きます。鉗子を使用して、肺への接触を最小限に抑えながら、心臓と肺を胸腔から慎重に取り除きます。次に、冷たいHEPES緩衝生理塩溶液を含むシールガードコーティングプレートに組織を置きます。

解剖ピンを使用して心臓と肺を固定し、大きな肺静脈と肺動脈がはっきりと見えるようにし、肺の左葉がわずかに伸びるようにします。大きな肺静脈を基準点として、細いハサミを使用して小さな肺間静脈を囲む組織を慎重に取り除きます。次に、小さな肺静脈を周囲の組織から静かに隔離します。

次に、DMSOを用いて2.5ミリモルのFluo-4 AMのストック濃度を調製します。原液を使用して、ローディング液を調製します。ローディング溶液と一緒に1.5ミリリットルのチューブに小さな肺静脈を置きます。

チューブをアルミホイルで覆い、摂氏37度の水浴中で1時間インキュベートします。小さな肺静脈をカニューレにするには、洗浄液から静脈を取り除きます。準備した圧力筋造影チャンバーに入れます。

先端の細い鉗子を使用して、小さな肺静脈の一方の端をカニューレの1つに慎重にカニューレを挿入し、ナイロン糸のマイクロフィラメントを使用して、小さな肺静脈のカニューレの端とカニューレの先端に結び目を結び、カニューレを固定します。生理的塩溶液をカニューレにそっと押し込み、肺静脈内の血液を取り除きます。ナイロン糸を使用して、マイクロフィラメントを使用してガラスカニューレでもう一方の端を結びます。

カルシウムイメージングでは、まずHEPES緩衝生理塩溶液を含むチューブにサーボ圧力コントローラーを取り付けます。コントローラーを使用して、小さな肺静脈を一方の端から加圧します。次に、蠕動ポンプを入口と出口、および出口に接続し、溶液をスーパーフュージョンします。

平衡化期間の後、40倍水浸対物レンズとスピニングディスク共焦点イメージングシステムを使用して、1, 000フレームのカルシウム画像を取得します。画像解析を実行するには、カスタム設計のSparkとソフトウェアを起動します。5 x 5 フィルターと中央値フィルターを使用して画像を滑らかにし、その後、肺静脈の平坦な領域をフレームで囲み、イベント自動検出用に複数のセルを使用します。

[表示]と[イベント自動検出]をクリックします。イベントのしきい値をF0の1.3Fの振幅に設定し、スキャンボックスの許容値を20%に設定し、移動平均を7つの画像に設定します。[検索の開始]または目のアイコンをクリックします。

表示メニューの下にある小さなイベントテーブルをクリックしてイベントテーブルを見つけ、検出されたカルシウムイオン信号の数を選択したフレームの面積で割って、マイクロメートル平方あたりのイベントを計算します。水銀管腔内圧5ミリメートルで小さな肺静脈に自発的に発生するカルシウムシグナルの数は、基礎条件下で1平方マイクロメートルあたり毎分0.73±0.2イベントでした。リアノジンの添加により、カルシウムシグナル伝達活性が劇的に低下しました。