インビトロ 補助人工心臓の血栓症検査

私たちは、補助人工心臓の潜在的な血栓形成ホットスポットを特定するための実用的でアクセス可能なベンチトッププロトコルを開発し、初期のプロトタイピングと動物実験の間の重要なギャップを埋めることを目指しています。動物実験は、補助人工心臓の血栓症を評価するための主要な方法として根強く残っています。数値流体力学は設計検証のための非常に貴重なツールとなっていますが、まだin vitroおよびin vivoの検証に取って代わることはできません。

血液凝固の存在と多数の交絡因子の複雑な性質により、実際のデバイスの血栓形成性と実験的アーティファクトを区別することは困難です。VADの血栓症を評価するためのin vitro法は依然として十分に活用されておらず、標準化された方法は今日まで存在しません。包括的なプロトコールとビデオガイドを提供することで、ベンチトップ法の幅広い採用を促進したいと考えています。

この方法は、医療機器開発における技術的および倫理的な課題に対処し、動物実験への依存を減らしながら、開発プロセスの早い段階で血栓症のリスクを検出する能力を向上させます。まず、テストループに150ミリリットルの血液を入れます。ループに閉じ込められたすべての空気を排除します。

軸流血液ポンプを使用する場合は、垂直位置に回転させて浮力によって空気を放出します。遠心ポンプを使用する場合は、ポンプを逆さまにして回転させ、二次流路に空気が閉じ込められないようにします。チューブとリザーバーの表面を軽くたたいて、気泡を絞って取り除きます。

チューブの水平部分とチューブとコネクタの間の接合部を綿密に検査して、気泡が存在しないことを確認します。静脈内バッグを絞って、液体レベルを狭い上部に近づけます。.次に、液体ラインを横切る止血器でバッグをクランプして、流体と空気の界面を排除し、エアベントストップコックを閉じます。

次に、圧力ラインの端にあるストップコックを閉じます。圧力計のチューブを取り外し、3ミリリットルの注射器を取り付けます。ストップコックを開き、1〜2ミリリットルの液体を延長線(約4センチメートル)に引き込みます。

ストップコックを閉じ、シリンジを取り外し、圧力計チューブを再度接続します。ストップコックを開いて、圧力の読み取りを有効にします。最後に、シリンジを使用してサンプリングポートをプライミングします。

次に、糸くずの出ないワイプを3等分にカットまたは引き裂きます。片片の角をひねって先端を形成し、注入口に挿入して残留血液を吸収します。2番目のフラグメントをひねります。

生理食塩水で湿らせ、濡れた先端をポートに挿入して、残っている血液をすべて取り除きます。3番目のフラグメントを使用して、ポートに残っている生理食塩水を吸収します。次に、補助人工心臓(VAD)を低速で始動し、約5秒間操作して、ポンプ内に閉じ込められた気泡を取り除きます。

ポンプを停止します。袋に気泡が出た場合は、空気を抜くことを繰り返してください。ポンプを低速で再起動して、ループ内の血液を循環させます。

1ミリリットルのヘパリンナトリウム、2ミリリットルの調製した塩化カルシウム溶液、および1.5ミリリットルのEDTAを別々のチューブに移します。ループ内の血液にヘパリンを添加するには、75ユニットのヘパリンをマイクロピペットに吸引し、ピペットの分注とシリンジプランジャーのこぼれないように引き抜くことを同時に行い、3ミリリットルのシリンジに分注します。三方活栓の横ポートを使用して、注射器でループに物質を投与します。

ストップコックのオスルアーロックを回転させて、注入口が上を向くようにして、上部の気泡を閉じ込めます。次に、ポートを上に向けてシリンジを垂直に下に向けて、ルアーロックを介してシリンジを注入ポートに取り付けます。シリンジプランジャーを引いて血液で満たし、シリンジに空気を吸引しながらヘパリンを血液と混合します。

気泡がシリンジの上部まで上昇するのを待ちます。次に、混合物をループに注入し、空気が入らないようにします。血液をシリンジに4〜5回出し入れして、ヘパリン化された血液がポート内のスペースに閉じ込められないようにします。

ループ内の血液の活性化凝固時間(ACT)を滴定するには、まず、ループ内の血液150ミリリットルに750マイクロリットルの1モル塩化カルシウム溶液を追加します。血液凝固を防ぐため、残った空気を取り除いた後、速やかに液を注入してください。あるいは、シリンジ内の塩化カルシウムを1ミリリットルのトリス緩衝生理食塩水で希釈して、早期凝固を減らします。

注入した塩化カルシウムを2分以上循環させた後、1ミリリットルのシリンジをサンプリングポートに取り付けます。0.5ミリリットルの廃血を採取して廃棄し、港から停滞した血液を取り除きます。次に、新しい1ミリリットルの注射器をサンプリングポートに取り付け、0.5ミリリットルの血液を採取して分析します。

ポイントオブケア全血凝固システムを使用して、活性化凝固時間を測定します。サンプリングポートをクリーニングしますamp前に示したように、糸くずの出ないワイプを使用します。滴定値を参照して、目標塩化カルシウム濃度をお知らせください。

カルシウム濃度を段階的に増加させて、300秒の活性化凝固時間を達成します。ループで300秒のACTが達成されたら、in vitro血栓症試験を開始します。ホフマンクランプを使用してローター速度を変更し、抵抗を調整することにより、ポンプを希望の流量と圧力に調整します。

前述したように、ループから血液サンプルを採取し、ACT装置に血液を一滴入れることにより、15分ごとにACTを測定します。ACTが200秒を下回った場合は、ループに追加で25ユニットのヘパリンナトリウムを注入します。1時間後、1.5ミリリットルの0.5モルEDTAをループに注入して、さらなる凝固を抑制します。

EDTAを循環させて2分間混合し、ポンプを停止します。止血器を使用して、ポンプの入口と出口に接続されたチューブをクランプし、クランプを入口と出口のバーブから3〜4センチメートル離して配置します。チューブを慎重に外して、ポンプを解放します。

次に、ポンプとフローループから血液を容器に排出します。最後に、ポンプの入口と出口から生理食塩水をピペットで流し、残留血液を洗います。血小板の沈着は、ポンプのプロトタイプのブレードの根に沿って一貫して観察されました。

チタン部品を電解研磨することで、これらの領域の血栓形成がなくなりました。また、試作機では、ハウジングの前後部分の接合部の取り込みが不完全で、血液が入り込んで凝固する隙間ができていました。ラッピングとポリッシングにより、コンポーネントのフィッティングが改善され、血栓形成が減少しました。

手続き上のエラーやループの不完全なエア解除により、アーティファクトが発生する可能性があります。この例では、塩化カルシウム注入中の実験エラーが局所的な凝固を引き起こし、結果として生じる血栓が遠心式リニアモーターポンプに入り、流路を閉塞しました。表面に観察される球状の緩く付着した血栓は、多くの場合、血栓内にカプセル化された気泡の結果です。

ループ内を循環する異物や異物も血栓に封入され、ポンプ表面に付着しました。チューブコネクタ接合部のリング血栓は、試験中の最適なACT範囲を示していました。