CRISPR-Cas9を用いた黄熱病ネ ッタイシマカ のゲノム編集

ここでは、CRISPR-Cas9技術を用いた蚊A . aegypti への胚マイクロインジェクションによるゲノム編集の詳細なプロトコールについて説明します。

私たちの研究範囲には、CRISPR-Cas9 テクノロジーを使用して遺伝子組み換え蚊の系統を確立することが含まれます。CRISPR‐Cas9技術を蚊の個体数抑制に用いるPgSITならびに遺伝子発現の空間的制御のためのバイナリ発現系の確立

CRISPR-Cas9技術を用いて、ノックアウトラインとノックインラインの両方を取得しました。当社のノックインラインには、組織特異的標識のための蛍光マーカーGFPやニューロン活動のレポーターであるG-CaMP6などの下流遺伝子の空間的時間的制御を可能にするQFトランスアクチベーターの挿入が含まれます。

新しい蚊の変異株の確立により、遺伝子機能と神経、生理学的、行動的影響をより深く理解できるようになります。これは、蚊が媒介する病気の伝播を防ぐ新しい方法の開発につながる可能性があります。私たちの研究室は、CRISPR-Cas9技術に依存して、男性の生殖能力と女性の生存率に関連する遺伝子をノックアウトする蚊の個体数抑制技術を開発しました。また、蚊の感覚耐性、特に嗅覚と視覚を研究するために、複数の蚊のラインを確立しました。

[インタビュアー]ノックアウト変異株用の注射コンストラクトを調製するには、Cas9希釈バッファーを使用してCas9タンパク質を目的の濃度に希釈します。次に、in vitroで合成したガイドRNAまたはgRNAのアリコートを超純水で希釈します。希釈したCas9タンパク質を各gRNAと予混合して、リボ核タンパク質複合体を形成します。次に、複数の予混合リボ核タンパク質複合体溶液を組み合わせます。相同性指向の修復媒介遺伝子カセット挿入の場合は、Cas9タンパク質とgRNAを希釈して混合します。ドナープラスミドを超純水で希釈し、すべてのコンストラクトを組み合わせます。次に、石英フィラメントを使用してマイクロインジェクション針を準備します。以下のプログラムを使用します。レーザーマイクロピペットプーラーで針を引っ張ります。手動吸引器をセットアップした後、白い丸のろ紙を湿らせ、内壁またはコレクター内の湿った綿の上に置きます。5〜10日前に血液を与えられた5〜10匹のメスの蚊をコレクターに入れます。次に、コレクターを暗所に45分間置きます。その後、コレクターから蚊を取り除きます。インキュベーション後、ろ紙を取り除いて胚を採取します。採取紙から薄灰色の胚盤葉前段階の胚を選択します。選択した胚を湿ったブラシで、カバースリップの上に置かれた両面粘着テープに移します。胚を平行に整列させ、周囲が濡れたまま、すべての後端が正面を向くように胚が並んでいるようにします。アライメント中に、乾燥を防ぐためにハロカーボンオイル700を胚に加えます。マイクロインジェクターで、300ヘクトパスカルの補正圧力と500ヘクトパスカルの注入圧力を設定します。マイクロローダーを使用して、3マイクロリットルの注入コンストラクトを針にロードします。整列した胚の入ったカバースリップを顕微鏡スライドに置き、顕微鏡の下に置いて注射します。次に、マイクロマニピュレーターで胚の後端に向かって10度の角度で針を針ホルダーに固定します。針の先端をカバースリップの端に軽く触れて、そっと開きます。次に、胚にプラスミド構築物を注入します。ネッタイシマカに注射コンストラクトを注射した後、糸くずの出ない使い捨てワイプを使用して、胚の周囲の油を取り除きます。脱イオン水を加えて胚をすすぎます。すすぎた胚を湿った濾紙に移し、濾紙をカラット9オンスのカップ内のウェットティッシュの上に置きます。次に、湿った綿をカップの底に置き、水分を保ちます。胚を3〜4日間湿らせた後、胚の入ったろ紙をSterilite6クォートパンの約3リットルの脱イオン水に移して孵化させます。Gゼロの幼虫が孵化したら、水と混ぜた魚の餌を鍋に加えます。3齢から4齢の幼虫段階で蛍光マーカーのGゼロ幼虫をスクリーニングします。蛍光状態に基づいて幼虫を分離します。蛍光陽性幼虫と蛍光陰性幼虫を別々の鍋に維持します。注射された蚊が蛹になるときは性別によって分離し、より小さいサイズ、より目立つ尖った生殖葉、およびより広いパドルによってオスを識別します。メスは、サイズが大きく、生殖葉が目立たず、パドルが狭いことで識別します。各性別の蛍光陽性または蛍光陰性の蚊をプールした後、蛍光スクリーニングされた個体ごとに3〜5匹の野生型個体の割合で、野生型リバプールA.アギプティ株の異性の蚊と各プールを交配し、4日間交尾できるようにします。3〜4日後、G1幼虫を3齢から4齢の幼虫段階で蛍光マーカーについてスクリーニングします。