結核菌と免疫受容体SLAMF1との相互作用の研究のための蛍光アッセイ
2025年2月28日
この研究は、 結核菌 とSLAMF1微生物センサーとの相互作用を評価するためのプロトコルを提供します。アッセイは、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法を用いて、ヒト単球由来マクロファージで実施しました。記載されているツールは、病原体と免疫受容体との間の相互作用の研究に関連しています。
私たちの研究は、結核菌とヒトのマイクロファージを発現する微生物センサーとの間の生化学的相互作用を研究するための有用なガイドを提供し、結核菌の線維細胞への侵入に関与するより硬い分子に関連しています。受容体相互作用は、レポーターマシン、気密分子、平準化組換えタンパク質、ノックアウト、ノックダウン、低発現モデルなど、通常使用するアプローチを用いて長年にわたって研究されてきました。これらの手法は、困難で、時間がかかり、場合によっては費用がかかる場合があります。
公開されたプロトコルを使用して、マクロファージでは、SLMF1受容体が結核菌と相互作用し、細菌の取り込みを促進し、エンドリソソームの成熟につながることを初めて示します。私たちは、遺伝子発現実験に伴う困難を克服し、新しい治療戦略のための新しいターゲットを記述しました。私たちのプロトコルは、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を使用して、結核菌とSLMF1微生物センサーとの間の生化学的相互作用を検出するための2つの選択肢を提供します。
この方法論には多くの潜在的な用途があり、他の研究状況にも簡単に適応できます。私たちは、全細胞の不活化および超音波処理細菌を使用して結核菌受容体の相互作用を評価する簡単なプロトコルを提供します。これはBSL2条件下で実行できますが、他の受容体や生株に容易に適応できます。必要に応じて、これらのアッセイは、異なる生きた病原体を用いたBSL3条件下でも実施できます。
まず、健康なドナーから採取した血液を慎重に50ミリリットルのチューブに移し、生理食塩水でその体積の半分に希釈します。密度勾配培地を調製し、サンプルを遠心分離して末梢血単核細胞(PBMC)を分離します。
細胞計数チャンバーで細胞をカウントした後、CD14ビーズで磁気選択を行い、CD14陽性単球を採取します。次に、単離した細胞をRPMI 1640培地に再懸濁します。CD14陽性単球500マイクロリットルを、血清非存在下で24ウェル細胞培養プレートの各ウェルに10倍10の濃度で播種し、接着を促進する。
2時間後、予熱したRPMI 1640培地でウェルを洗浄し、非接着性細胞を除去します。1ミリリットルの完全RPMI 1640培地を16〜18時間使用して、単球をマクロファージに分化します。翌日、ウェルを1ミリリットルのPBSで洗浄し、各ウェルに1ミリリットルの完全なRPMI 1640培地を追加します。
10マイクロリットルの超音波処理された結核菌抗原でマクロファージを24時間刺激します。翌日、P-1000ピペットを使用して、プレートのウェルから完全なRPMI培地を廃棄します。冷たいPBSを加え、ピペットで上下させてマクロファージを採取します。
細胞を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移します。チューブを500Gで摂氏4度で5分間遠心分離します。上清を捨て、ペレットを補充した放射性免疫沈降アッセイバッファーに再懸濁します。
懸濁液を氷上で1時間インキュベートし、10分ごとにボルテックスします。懸濁液を14, 000Gで15分間遠心分離し、上清を収集します。回転するマイクロチューブホルダーで、回転するマイクロチューブホルダー内で、50マイクロリットルのタンパク質抽出物から1×10の6マクロファージの累乗で、1×10を6つのマクロファージの累乗で1×10にインキュベートします。
翌日、タンパク質細菌複合体を染色するために、マイクロチューブに抗ヒトSLAMF1抗体を添加し、混合物をボルテックスし、暗所で摂氏4度で30分間インキュベートします。タンパク質細菌複合体をFACSで洗浄した後、それらをFACSバッファーに再懸濁し、フローサイトメーターでサンプルを採取します。丸い鼻の外科用ピンセットを使用して、12ミリメートルの丸いカバーを24ウェル培養プレートのウェルに滑り込ませます。
カバースリップを結核菌ローダミン抗原と37°Cで1時間インキュベートします。インキュベーション後、300マイクロリットルのPBSで希釈した100マイクロリットルのタンパク質抽出物を加え、撹拌しながら室温で2時間インキュベートします。培養プレートの蓋をパラフィンフィルムで包みます。
以前に滴定した抗SLAMF1一次抗体を60マイクロリットル滴下し、パラフィンフィルムで覆われた蓋に添加します。湾曲した細い先端の外科用ピンセットと針を使用して、カバースリップをプレートから慎重に取り外します。一次抗体溶液および二次抗体溶液とインキュベートした後、余分な液体を取り除き、スライドガラスの上に置いた一滴の封入液にカバースリップをマウントします。
スライドを蛍光顕微鏡に置き、適切なフィルターを使用して細胞を観察します。単球は95%以上の純度でPBMCから単離に成功し、単球由来マクロファージは接着および一晩培養後に生成されました。SLAMF1表面発現は、結核菌抗原で刺激されたマクロファージで誘導され、そのレベルはフローサイトメトリーを用いて確認されました。
SLAMF1と結核菌全細胞との相互作用は、架橋アッセイとそれに続くフローサイトメトリーを用いて実証されました。SLAMF1と結核菌抗原との相互作用を蛍光顕微鏡で可視化し、共局在をマージ画像で確認しました。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
この研究は、結核菌とSLAMF1微生物センサーの相互作用を評価するためのプロトコルを提供します。アッセイは、フローサイトメトリーと蛍光顕微鏡を用いてヒト単球由来マクロファージで実施されました。
主要な研究要素
科学分野
- 微生物学
- 免疫学
- 細胞生物学
背景
- 結核菌は重要なヒトの病原体です。
- SLAMF1は免疫応答に関与する微生物センサーです。
- 病原体と受容体との相互作用を理解することは、治療戦略を開発する上で重要です。
- ヒト単球由来マクロファージは結核感染における重要な免疫細胞です。
研究の目的
- 結核菌とSLAMF1の相互作用を評価すること。
- これらの相互作用を研究するためのプロトコルを確立すること。
- 免疫系による病原体認識の理解を深めること。
使用した方法
- 細胞間相互作用の定量化のためのフローサイトメトリー。
- 病原体の取り込みを視覚化するための蛍光顕微鏡。
- モデルシステムとしてのヒト単球由来マクロファージの使用。
- SLAMF1の関与を評価するためのアッセイの設計。
主要な結果
- 結核菌とSLAMF1の相互作用の実証。
- フローサイトメトリーの結果は、重要な結合イベントを示しました。
- 蛍光顕微鏡は相互作用の視覚的確認を提供しました。
- この研究結果は病原体による免疫回避の理解に貢献します。
結論
- この研究は将来の研究のための価値あるプロトコルを提示しています。
- 得られた洞察は結核に対する治療アプローチに情報を提供する可能性があります。
- SLAMF1のさらなる探索は免疫学的知識を深める可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Directly quantifying the interaction between Mycobacterium tuberculosis and the immune receptor SLAMF1 addresses a critical gap in early-stage target validation for infectious disease research. The described fluorescence-based assays enable mechanistic de-risking by providing robust, quantitative evidence of pathogen-receptor engagement without reliance on transgenic models. This capability supports predictive confidence in immunological target selection and informs portfolio decisions in host-pathogen interface programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of pathogen-immune receptor interactions in human-derived systems.
- Supports functional validation of SLAMF1 as a microbial sensor relevant to tuberculosis.
- Provides mechanistic clarity for prioritizing immune targets in infectious disease pipelines.
Screening & Assay Development
- Establishes reproducible, quantitative assays using flow cytometry and fluorescence microscopy.
- Facilitates standardization of pathogen-receptor binding measurements for downstream screening.
- Prepares validated biological systems for scalable compound or antibody evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant immune mechanisms in tuberculosis.
- Enables continuity from discovery-stage validation to preclinical model selection.
- Supports risk-adjusted advancement of immunomodulatory strategies targeting SLAMF1.
Pipeline & Workflow Integration
These fluorescence assays position within the early discovery to lead identification continuum, providing foundational data for target validation and assay readiness in infectious disease research.
- Discovery Biology: Quantifies direct SLAMF1-pathogen interactions to clarify immune recognition pathways.
- Screening: Delivers standardized, reproducible readouts suitable for comparative analysis across conditions.
- Analytics: Generates quantitative binding data supporting statistical evaluation of immune engagement.
- Translational Research: Bridges in vitro immune receptor validation with preclinical model development for tuberculosis.
- Enterprise Reuse: Provides a broadly applicable platform for studying diverse pathogen-immune receptor interactions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in immune target selection and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Enables standardized, scalable, and reproducible immune interaction assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency in infectious disease portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of immunological targets for further development.
Implementation Considerations
- Requires expertise in flow cytometry, fluorescence microscopy, and immune cell handling.
- Demands access to analytical instrumentation and validated antibody reagents.
- Necessitates cross-team standardization of assay protocols and data analysis.
- Adaptable to other pathogen-receptor systems with appropriate reagent development.
- Dependent on quality of primary cell extracts and antigen preparations.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:11
Monocyte-Derived Macrophage Culture, Stimulation, and Protein Extraction
4:42
Investigating SLAMF1- Mycobacterium tuberculosis Interaction by Flow Cytometry
5:32
Investigating SLAMF1- Mycobacterium tuberculosis Interaction by Fluorescence Microscopy
6:42
Representative Results
