Name: ウサギ筋肉からの筋小胞体Ca2+-ATPaseの精製 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: 学ぶウサギ筋肉からのSERCA精製法。トレハロースを用いた超遠心分離で90%以上の純度を達成し、高い触媒活性と構造安定性を確認。P型ATPaseの機能解析と構造生物学研究に応用可能です。

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すべての動物処置は、実験実験室での動物の取り扱いに関する国際的および地域的(NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999)ガイドライン51,67,68に従って実施されました。筋肉組織は、地元の動物取り扱いユニット(INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)から野生型Oryctolagus cuniculusから得られた46。実験動物管理の専門知識を持つ獣医師が、最初の筋肉解剖と処理を行いました。本試験で使用した試薬および装置の詳細は、材料表に記載されています。
1. 速筋ウサギ筋からの筋小胞体の単離(タイミング、7〜9時間)
注:手順の詳細については、Champeil et al.69を参照してください。
<ol>
	<li>野生型 Oryctolagus cuniculusから速筋組織(動物1匹あたり両後肢から~70g)を取得します。 注:解剖する筋肉の事前の視覚的識別が必要です70,71。</li>
	<li>ブレンダーで速筋を100 mMのKClの3つの容量に懸濁し、1分間オンにし、1分間氷冷した休息で1分間、72回3回繰り返します。</li>
	<li>遠心分離(1500 × g)により、4°Cで5分間、組織破片を除去します。必要に応じて、2回目の遠心分離(4200 × g)を行います。</li>
	<li>上清を収集し、ティッシュグラインダー(低速で10ストローク、すなわち500〜1,500rpm)を使用して均質化します72,73。ホモジネート(10,000 × g)を4°Cで15分間遠心分離します。 注:均質化する場合は、比較的高速を使用するとシステムとオペレーターに損傷を与える可能性があるため、注意が必要です。</li>
	<li>上清(筋小胞体を含む)(33,000 × g)を4°Cで120分間遠心分離します。</li>
	<li>ペレットを0.5 Mショ糖40 mLに懸濁し、4°C(12,000 × g)で15分間遠心分離します。上清(0.6 MのKClと0.15 Mのスクロース)を希釈し、懸濁液(34,000 × g)を4°Cで165分間遠心分離します。</li>
	<li>筋小胞体小胞(SRV)シートを含むペレットを、0.3 Mのスクロース、0.1 MのKCl、および5 mMのTris-HCl、pH 7.0に懸濁します。Lowry assay74 とヒト血清アルブミンをタンパク質標準試料として使用して、タンパク質濃度を測定します。</li>
	<li>SRV(30-32 mg / mL)を1 mLの容量で分注します。.SRVサンプルは、さらなる処理のために-72°Cで保存します。 注:タンパク質収量は、動物あたり100〜110 mgのSRVです。</li>
</ol>
2. SERCA精製(タイミング、18〜20時間)
注:手順の詳細については、Rivera-Morán et al.46を参照してください。
<ol>
	<li>氷冷した75 mMのTris-HCl、pH 7.2、0.6 MのKCl、6 mMのEDTA、1 mMのEGTAおよび0.1%(w / v)デオキシコール酸(DOC)を使用して、SRV懸濁液を2 mgのタンパク質/mLに希釈します。SRV懸濁液を氷上で10分間インキュベートし、穏やかに攪拌します。SRV懸濁液(100,000 × g)を4°Cで60分間遠心分離します。 注:DOCは一滴ずつ追加する必要があります。</li>
	<li>ペレットを&lt;3 mLの25 mMのTris-HCl、pH 7.5、0.3 MのKCl、45%グリセロール(v/v)、および2 mM EDTAに懸濁します。懸濁液を均質化し、最終容量の10mLに調整します。タンパク質濃度を決定し、6.5 mg/mLに調整します。アゾレクチンを5 mg/mLおよび0.85(w/w)Zwittergent 3-14で添加します。 注:アゾレクチンと双性体3-14は一滴ずつ追加する必要があります。</li>
	<li>懸濁液を均質化し、(100,000 × g)を4°Cで60分間遠心分離します。上清を回収し、2 mMのEGTAで1:2に希釈します(pH 7.2)。</li>
	<li>懸濁液を、10 mMのTris-HCl、pH 7.0、1 mMのEDTA、0.1%デオキシコール酸、および1 mg/mLのアゾレクチン中の不連続なトレハロース濃度勾配(45、40、35、および30%w/v)に穏やかに注ぎます。遠心分離機(100,000 × g)を4°Cで14時間遠心分離します。チューブの底に形成された透明でわずかに黄色がかったペレットを収集します。 注:トレハロースグラジエントの形成とサンプル懸濁液の添加は、どちらも適切な技術を用いて行わなければなりません。一晩の遠心分離をお勧めします。</li>
	<li>ペレットを少量(&lt;1.5 mL)の25 mMのTris-HCl、pH 7.5、0.3のM KCl、45%グリセロール、および2 mMのEDTAに穏やかに懸濁します。タンパク質濃度を決定します。タンパク質濃度を2 mg / mLに希釈して調整します。懸濁液のアリコート(~50 μL)を採取し、精製したSERCAを-72°Cで使用まで保存します。</li>
	<li>精製されたSERCA72のSDS-PAGEと、精製の異なるステップで採取したタンパク質サンプルのSDS-PAGEを実行します。ジェルをクマシーブルー72で染色します。 注:懸濁液緩衝液中のグリセロールの代わりに0.6Mトレハロースを使用すると、保存および凍結融解サイクル28,29中の酵素の安定性が向上する。</li>
</ol>
3. ATPase活性のアッセイ(タイミング、1〜2時間)
<ol>
	<li>酵素共役アッセイ:ATPase-ピルビン酸キナーゼ-乳酸デヒドロゲナーゼ<ol>
		<li>反応混合物(1 mL)を調製します:50 mM MOPS(pH 7.0)、1 mM EGTA、80 mM KCl、5 mM MgCl2、3 mM CaCl2、5 mMホスホエノールピルビン酸、250 μM NADH。可変ATP濃度(0.001〜0.25 mM)を含めます。</li>
		<li>ボルテックスにより、反応アッセイを慎重に均質化します。反応アッセイを37°Cで10分間インキュベートし、0.9 U L-乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)と1.5 Uピルビン酸キナーゼ(PK)を加えます。</li>
		<li>10 μgのSERCAを添加してATPase反応を開始します。</li>
		<li>NADHの形成を決定します。サーモスタット付きセルホルダー付きの分光光度計を使用して、波長340nmの波長(λ)で600秒間、毎秒吸光度強度の経時変化を追跡します。 注:吸光度測定の時間間隔は異なる場合がありますが、ATPase反応の初期直線を描くために、できるだけ多くのデータポイントを記録するようにしてください。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP加水分解の速度を決定する 注:手順の詳細については、Rivera-Morán et al.46を参照してください。<ol>
		<li>形成された各曲線の線形部分の勾配値(Δabs/min)を計算します。NADH(λ = 6,220 M-1・cm-1)のモル吸光係数(ε)を使用して、ATPアーゼ活性(μmoles ATP hydrolyzed/min.mg prot.)を決定します。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>動力学パラメータKmおよびVmaxを決定します
	<ol>
		<li>データ解析およびグラフ作成ソフトウェアを使用して、速度データとATP濃度をプロットします。</li>
		<li>非線形回帰によってデータをMichaelis-Menten方程式(式1)46に当てはめます。 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> ここで、 v は速度、 Vmax は最大速度、[S] は ATP 濃度、[ Km ] は Michaelis-Menten 定数です。</li>
		<li>Km と Vmax を反復で決定します。 注:DOCを含めると、ATPアーゼ速度の応答が増加する可能性があります。最適な濃度を見つけるために、さまざまな濃度のDOCをテストすることをお勧めします。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. フルオレセインイソチオシアネート(FITC)によるSERCAの標識アッセイ(タイミング、30〜45分、FITC標識のみ)
注:手順の詳細については、54、75、76を参照してください。
<ol>
	<li>SETCを1 mMのFITCを含む標識バッファー(100 mMのKCl、5 mM MgCl2、および30 mMのTris-HCl、pH 8.9)の50 μL(最終容量)にSERCA(20 μg)を懸濁します。ボルテックスで混ぜます。</li>
	<li>サンプルを異なる時間(15分、10分、7分、5分、2分)で暗所および室温でインキュベートします。</li>
	<li>ATP(5 mM)を含む1容量の氷冷停止バッファー(480 mMのスクロースと48 mMのMOPS、pH 7.0)を添加して、標識反応を停止します。暗闇の中で氷上で5分間インキュベートします。</li>
	<li>FITCでラベル付けされたSERCAをSDS-PAGE72に提出します。透明ゲルを紫外線(λ = 302 nm)にさらします。結果を写真で記録します。</li>
	<li>ジェルをクマシーブルーで染色します。結果を写真で記録します。 注:暗室でFITC標識を行うと、蛍光シグナルの品質が向上する可能性があります。</li>
</ol>
5. 円二色性(CD)スペクトル(タイミング、30分)
注意: 手順の詳細については、11,77を参照してください。
<ol>
	<li>SERCA (3 μM) を 400 μL の 10 mM リン酸バッファー (pH 7.0) に 25 °C で懸濁します。</li>
	<li>光路長0.1cmのセルにサンプルをロードします。遠紫外スペクトルのλ範囲を190〜260nmに設定します。内部分解能と帯域幅を 1nm に設定します。</li>
	<li>CD信号を50 nm/min、25°Cで記録します。</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>大豆由来のアゾレクチン</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>ベンチトップ UV トランスイルミネーター&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>デュアル強度 高設定は、分析文書化に最適です。低設定により、分取作業中のゲルサンプルのフォトニッキングまたは光退色が減少します。</td></tr><tr><td>CaCl2 & 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500 カメラ&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>クマシー ブリリアント ブルー G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル マルトシド</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>エチレングリコール-ビス (2-アミノエチルエーテル)-N,N,N&prime;,N&prime;-四酢酸</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>エチレンジアミン四酢酸四ナトリウム塩二水和物 &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>フルオレセイン イソチオシアネート</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 & 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-ImpexInternational Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニウム-1-プロパンスルホン酸シ</td><td>グマ・アルドリッチ社</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>ホスホエノールピルビン酸 (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ筋乳酸デヒドロゲナーゼ</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>ウサギ筋ピルビン酸キナーゼ</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>デオキシコール酸ナトリウム</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>分光偏光計&nbsp;</td><td>ジャスコ株式会社</td><td>ジャスコ J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>スクロース</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>トレハロース</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>二水和物</td></tr><tr><td>トリス (ヒドロキシメチル) アミノメタン</td>塩酸塩 <td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>超遠心分離機</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS 分光光度計&nbsp;</td><td>アジレントテクノロジーズ</td><td>8453</td><td>アジレント 8453 紫外可視分光光度計は、フォトダイオードアレイを使用して、紫外線から可視光のスペクトル全体を同時に測定</td></tr>します <tr><td>WiseStir HS-30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>DHです。WOS01010</td><td>ティッシュグラインダー用に設計された、すべての分散および均質化アプリケーションに最適です。</td></tr></tbody></table>

ウサギ筋肉からの筋小胞体ca2+-atpaseの精製

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

精製のさまざまな段階におけるSERCAのSDS-PAGE(図1)。Coomassieブルー染色ゲルは、精製プロトコルが進行するにつれて、SERCAタンパク質バンド(見かけの分子量&gt;100 kDa)の濃縮を示しています。SERCAに対応するタンパク質バンドは、トレハロース濃度勾配での遠心分離後、&gt;90%の純度を示します。ATP加水分解速度とATP濃度のプロット(図2A)。Michaelis-Menten ATPase速度論(双曲線パターン)は、精製されたSERCAで観察されます。図2A(図2B)のデータのLineweaver-Burkプロット。プロットでは、SERCAのKm値(10μM)は、x切片(K m-1)から得られており、これは以前の研究25,78,...

ウサギ筋肉からの筋小胞体Ca2+-ATPaseの精製

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

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