ウサギ筋肉からの筋小胞体^Ca2+-ATPaseの精製

私たちの研究は、トレハロースが精製中にSERCAを安定化し、その安定性と機能性を高めるかどうかを調査しながら、高い構造品質と触媒活性を備えたSERCAを精製することに焦点を当てています。オリゴマ状態におけるP型ATPアーゼの三次元構造の決定ATPアーゼ構造モデリング、構造ダイナミクスシミュレーション、リガンドの分子ドッキングに人工知能を使用し、疾患治療法を探索し、タンパク質機能解析と新しい技術を改善します。現在の課題には、P-ATPアーゼのエネルギー変換メカニズムの理解、四次構造が機能と活性をどのように調節するかの解明、ヒト疾患への治療応用のための効果的な阻害剤の特定が含まれます。GS原形質膜プロトン-ATPアーゼの六量体状態を確認し、Kramersの理論で記述されたように、その構造ダイナミクス依存性または中粘度を実証します。

[ナレーター]まず、野生型のOryctolagus cuniculusから速筋を取得します。浸軟のために100ミリモルの塩化カリウムを3容量で懸濁します。1分間ブレンドした後、1分間氷のように休ませます。サンプルを摂氏4度で1,500 gで5分間遠心分離し、組織の破片を除去します。上清をチューブに集め、ティッシュグラインダーで均質化します。次に、ホモジネートを遠心分離し、続いて上清を遠心分離します。ペレットを約40ミリリットルの0.5モルスクロースに懸濁します。次に、懸濁液を摂氏4度で12,000 gで15分間遠心分離します。得られた上清を0.6モルの塩化カリウムと0.15モルのスクロースで希釈してから遠心分離します。筋小胞体小胞シートを含むペレットを、0.3モルスクロース、0.1モル塩化カリウム、および5ミリモルトリス塩酸塩を含む緩衝液にpH 7.0で懸濁します。筋小胞体小胞を1ミリリットルの容量で分注します。筋小胞体小胞懸濁液を氷上で10分間穏やかに攪拌しながらインキュベートし、遠心分離します。ペレットを3ミリリットル未満の25ミリモルのトリス塩酸塩緩衝液に懸濁します。懸濁液を均質化した後、トリス塩酸塩緩衝液で最終容量10ミリリットルに調整します。Lowryアッセイを使用してタンパク質濃度を測定します。アゾレクチンを1ミリリットルあたり5ミリグラムで添加し、次に0.85 Zwittergent 3-14を追加します。懸濁液を再度均質化し、摂氏4度で100,000 gで60分間遠心分離します。上清を新しいチューブに集めます。pH 7.2で2ミリモルのEGTAで1対2の比率で希釈します。懸濁液をTrisバッファー中の不連続なトレハロース濃度勾配に穏やかに注ぎます。次に、以前と同じように遠心分離し、透明でわずかに黄色のペレットを収集します。ペレットを少量のトリスバッファーに穏やかに懸濁します。タンパク質濃度を測定し、希釈してタンパク質濃度を1ミリリットルあたり2ミリグラムに調整します。ATPアーゼ活性については、1ミリリットルの反応混合物を調製します。反応アッセイをボルテックスして均質化し、摂氏37度で10分間インキュベートします。0.9単位のL-乳酸デヒドロゲナーゼと1.5単位のピルビン酸キナーゼを加えます。10マイクログラムのSERCAを加えて、ATPアーゼ反応を開始します。NADの形成を決定するために、サーモスタットセルホルダーを備えた分光光度計を使用して、340ナノメートルで600秒間、毎秒の吸光度変化を監視します。フルオレセインイソチオシアネート(FITC)によるSERCAの標識アッセイでは、最初に20マイクログラムのSERCAを50マイクロリットルの標識バッファーに懸濁します。ボルテックスをよく混ぜます。次に、サンプルを室温で暗所で15、10、7、5、および2分間インキュベートします。標識反応を止めるには、同量の氷冷停止バッファーを加えます。暗闇の中で氷の上で5分間インキュベートします。FITC ラベルの付いた SERCA を SDS-PAGE に従わせます。透明なゲルを波長302ナノメートルの紫外線にさらし、結果をフォトレテグレーションします。最後に、ジェルをクマシーブルーで染色します。結果を写真で記録します。円二色性スペクトル分析では、まず SERCA を摂氏 25 度で pH 7.0 の 10 ミリモルリン酸緩衝液 400 マイクロリットルに懸濁します。サンプルを経路長0.1センチメートルのセルにロードします。次に、遠紫外スペクトル範囲を190〜260ナノメートルに設定し、内部分解能と帯域幅を1ナノメートルに設定します。摂氏25度で毎分50ナノメートルの速度で円二色性信号を記録します。クマシーブルー染色のSDS-PAGEゲルは、精製が進むにつれてSERCAタンパク質バンドの濃縮を示しました。トレハロース濃度勾配での超遠心分離を使用した最終SERCA精製ステップでは、純度が90%を超えました。筋小胞体小胞には大量のSERCAが含まれており、小胞内の総タンパク質の約73%がこのP-ATPアーゼに対応していました。 精製されたSERCAについて、ATP加水分解速度対ATP濃度曲線でMichaelis-Menten速度論パターンが観察され、その酵素機能が確認されました。Lineweaver-Burkプロットは、以前に報告された値と一致する、ATPの約10マイクロモルのミカエリス定数を明らかにしました。SERCAのFITC標識は、無傷のヌクレオチド結合部位を示しました。クマシーブルーに染まったSERCAバンドは、FITCラベルのバンドと正確に一致していました。円二色性分光法により、精製されたSERCAの高い構造品質が確認され、そのスペクトルは明確に定義された二次構造要素を示しています。