マウス脳脊髄サンプルの抽出および組織透明化調製
2025年4月11日
この研究では、蛍光シグナルを保持した透明な全脳および脊髄サンプルを抽出および調製するためのプロトコルを提示し、実験効率とデータの完全性を高めて神経科学研究を前進させます。
私たちの研究は、中枢神経系が認知機能をどのように媒介し、免疫系と相互作用するかに焦点を当てています。私たちは、脳と脊髄を検査する方法を改善し、これらの相互作用に関する基本的な問題に対処することを目指しています。これらの方法は、脳全体と脊髄を無傷に保つため、組織のクリアリングを使用して細胞をより徹底的にマッピングするのに役立ちます。また、プロセスがより迅速かつ正確になり、従来の切片化およびイメージング方法と比較して時間とミスが削減されます。
私たちは、脳と肺に接続された脊髄領域をマッピングし、 を生み出しました。私たちの研究は、脳、脊髄、肺の間の神経免疫コミュニケーションの探索に焦点を当てます。そして、この相互作用が免疫応答にどのように影響するか。
[講師]まず、スチール製のクランプを使用してマウスの手足を幅の広いアクリル板に固定します。はさみを使用して、2つの大腿骨の間の皮膚を切り、横隔膜に達するまで上向きに切り続けます。はさみとまっすぐな鉗子を使用して心臓を露出させ、横隔膜を通して胸部の両側を開きます。灌流チューブに取り付けられた0.7ミリメートルの輸液針を左心室に挿入し、右心耳に1〜2ミリメートルの切開を行います。灌流後、眼科用ハサミを使用してマウスの背中と頭の皮膚を分離します。両肢の上後縁を結ぶ線が脊柱と交差する点で脊椎を切断します。マウスの首と背中から筋肉と脂肪組織を取り除き、背骨と頭蓋骨を露出させます。静脈ハサミで、脊椎と脊髄の左右の間の正中線の隙間に沿って椎管の下端から切ります。次に、切断された脊椎の上部と両側を取り除き、脊髄を露出させます。脳の接続に到達するまで手順を繰り返します。静脈ハサミの片方の刃の先端を大孔と脳の間に置きます。正中矢状縫合糸に沿ってスライドさせて切断し、頭蓋骨を開きます。鉗子を使用して頭蓋骨を取り除き、脳を露出させます。次に、鉗子と静脈ハサミを使用して、マウスの脳脊髄組織を頭蓋端から取り除きます。解剖鉗子を使用して、実体顕微鏡下で脊髄膜を除去します。次に、縫合糸を使用して、脳脊髄サンプルを固定プレートに固定します。サンプル量の少なくとも20倍の4%パラホルムアルデヒドを加えます。固定後、パラホルムアルデヒドを廃棄し、サンプルをPBSで3回洗浄します。まず、抽出したマウス脳脊髄をパラホルムアルデヒドで固定します。脂質除去液の場合、溶液AとBを9対1の質量比で混合します。50ミリリットルの脂質除去液を50ミリリットルの遠心分離管に加え、固定組織をその中に入れます。溶液Cでインキュベートした後、溶液を変更し、サンプルを溶液Cに完全に浸した培養皿をスケールライン付きのライトボックスに置きます。ゲル溶液を調製するには、147グラムの溶液Cと3グラムのアガロースを200ミリリットルのガラス瓶に加えます。成分を攪拌棒でよく混合し、アガロースが溶けるまで電子レンジで加熱します。ゲル溶液を摂氏37度に設定した実験用オーブンに移します。37°Cのテンパリングゲル溶液を2mmの深さで型に注ぎ、4°Cの冷蔵庫で半固体になるまで30分間冷却します。屈折率が一致したサンプルを金型に入れ、サンプルの上部のレベルまたはわずかに下までゲル溶液を追加します。型を摂氏4度の冷蔵庫に戻して2時間置きます。カバースリップで覆い、再び冷蔵します。ピンセットでカバースリップを取り外し、埋め込まれたサンプルを取り出します。50ミリリットルのチューブに30ミリリットルのイメージング溶液を加え、サンプルを溶液に浸します。502接着剤を塗布してサンプルをサンプルホルダーにしっかりと貼り付けてから、ホルダーをイメージングデバイスに固定します。スキャン ソフトウェアを実行し、倍率セクションで 4 倍の倍率レベルを選択します。キャリブレーションボタンをクリックして、キャリブレーションモードをアクティブにします。プレビューボタンをクリックしてプレビューモードに入ります。次に、Z方向の移動ボタンをクリックして、生成されたライトシートがサンプルを通過するまで、サンプルチャンバーの下部からサンプルをゆっくりと上に移動します。適切なレーザーチャネルと照明モードオプションを選択します。サンプルのスキャンパスの方向を選択します。自動スキャンボタンをクリックして、サンプルの画像のキャプチャを開始します。このプロトコルは、鮮明なイメージングのために無傷の蛍光シグナルを維持しながら、マウスの脳と脊髄全体を保存することに成功しました。脳脊髄サンプルの蛍光イメージングにより、詳細な神経構造がはっきりと視覚化されました。 高倍率の画像により、個々の蛍光標識細胞の視覚化が強化されました。
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概要
この研究は、蛍光シグナルを保持しながら、クリア化された脳全体および脊髄サンプルを抽出し、準備するためのプロトコルを提示しています。この手法は実験効率を向上させ、神経科学研究を進歩させるためにデータの完全性を維持します。開発された方法は、従来の切片化とイメージング技術に対する、より迅速で正確な代替手法を提供します。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 神経免疫学
- 組織クリア技術
背景
- 認知機能における中枢神経系の役割を調査します。
- 脳、脊髄、免疫系の相互作用を探求します。
- 神経-免疫コミュニケーションに関する基本的な問いに取り組みます。
研究の目的
- 脳と脊髄の構造を調べる方法を改善します。
- 完全な組織内の細胞構造のマッピングを促進します。
- 従来の方法と比較してエラーと処理時間を削減します。
使用された方法
- 研究では、マウスの脳と脊髄サンプルに組織クリアプロトコルを使用しました。
- 詳細な細胞マッピングのために、全脳と脊髄組織を使用しました。
- 蛍光シグナルを維持するために、灌流とサンプル固定を含む複数の重要なステップを含みました。
- サンプルの埋め込みとイメージングのための体系的なアプローチに従いました。
主な結果
- プロトコルは神経構造の明瞭なイメージングのために蛍光を成功裏に保持しました。
- 詳細な神経構造が視覚化され、脳と脊髄の接続性に関する洞察を提供しました。
- 強化されたイメージングにより、個々のラベル付けされた細胞の観察が可能になり、神経解剖学の理解が向上しました。
結論
- この研究は、完全およびクリア化された脳と脊髄サンプルがイメージングの品質を大幅に向上させることを示しています。
- この発見は、神経-免疫相互作用の理解を向上させます。
- この影響は、健康および疾病の文脈における神経メカニズムの探索にまで及びます。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Preserving intact brain-spinal cord connectivity through advanced tissue clearing enables comprehensive mapping of neural and immune interactions, addressing a critical bottleneck in CNS target validation. This protocol streamlines sample preparation and imaging, reducing manual error and accelerating data acquisition for early discovery and translational research. Enhanced imaging fidelity supports predictive confidence in mechanistic studies and portfolio triage for neuroimmunology programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables high-resolution mapping of neural circuits and immune interfaces in intact CNS tissue.
- Supports mechanistic de-risking by preserving spatial relationships critical for target validation.
- Facilitates hypothesis-driven interrogation of neuroimmune pathways relevant to disease models.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible whole-organ samples for downstream imaging workflows.
- Delivers quantitative, high-content imaging outputs suitable for comparative analysis.
- Improves assay readiness by maintaining fluorescent signal integrity throughout processing.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant system studies by enabling visualization of CNS-immune connectivity.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by preserving anatomical context.
- Reduces translational risk by enabling more accurate modeling of neuroimmune mechanisms.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol integrates at the interface of early discovery and preclinical research, supporting lead identification and mechanistic studies in neuroimmunology.
- Discovery Biology: Advances hypothesis testing and pathway clarification by enabling intact tissue analysis.
- Screening: Standardizes sample preparation for reproducible, quantitative imaging outputs.
- Analytics: Provides high-resolution, multi-channel imaging data for robust statistical comparison.
- Translational Research: Maintains anatomical and molecular fidelity for biomarker alignment and disease modeling.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for CNS tissue clearing and imaging across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS target validation.
- Operational Value: Streamlines sample processing, enhances reproducibility, and supports high-throughput imaging.
- Strategic Value: Enables more informed go/no-go decisions and reduces late-stage biological risk in neuroimmunology portfolios.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of CNS and immune-modulating assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CNS dissection, tissue clearing, and advanced imaging techniques.
- Demands access to specialized imaging platforms and analytical infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for reproducible sample preparation and imaging protocols.
- May require adaptation for different animal models or tissue types based on research focus.
- Potential limitations include tissue integrity challenges and the need for careful handling to preserve fluorescent signals.
