Name: がん細胞のノンコーディングRNA間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルCRISPR干渉戦略 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶデュアルCRISPRiシステムを用いたメラノーマ細胞における長鎖非コードRNAの合成致死相互作用の標的化。この手法は、がん治療における新たな治療戦略の開発に貢献します。

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<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
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ヒトゲノムの3%未満がタンパク質をコードしていますが、ゲノムの約80%が転写されています1,2。ノンコーディング転写単位のうち、数万個が200ヌクレオチドを超える長鎖ノンコーディングRNA(lncRNA)に分類され、ヒトlncRNAの総数は10万個を超えると推定されています3,4。遺伝子をコードするのとは対照的に、lncRNAは種間であまり保存されていません。ヒトがゲノムの99%をチンパンジーのような霊長類と共有していることを考えると、lncRNAは表現型の進化にはるかに大きな影響を与えると仮定されています5,6。これらの知見は、lncRNAの重要な細胞機能を示しています。lncRNAの制御およびRNA結合タンパク質や他のRNAとの相互作用は未だ完全には理解されておらず、多くのlncRNAにはまだ完全にはアノテーションされていませんが、lncRNAががんなどの健康や疾患において細胞および組織特異的な発現パターンを示すことは明らかです7,8,9,10。それらは、遺伝子転写制御、クロマチン相互作用への関与11、RNAプロセシング12、RNA安定化13、翻訳の制御14など、多様な機能に関与している。
がんでは、非常に多様な細胞型特異的なlncRNAが遺伝子発現を調節することで腫瘍の発生と転移に影響を与え、貴重な治療標的としての可能性が浮き彫りになっています15。腫瘍サンプル中のバイオマーカーとしてのlncRNAの検出だけでなく、腫瘍特異的なlncRNAを標的にしてその下流機能を破壊することは、臨床応用と基礎研究の両方で大きな可能性を秘めています。lncRNAの役割を解明するためのRNAベースのアプローチには、アンチセンスオリゴヌクレオチド(ASO)、ショートヘアピンRNA、および低分子干渉RNA(siRNA)が含まれます17,18。siRNAは一般的に遺伝子サイレンシングスクリーニングに利用されますが、siRNAベースのノックダウンは細胞質に限定されています19。しかし、lncRNAはしばしば核内で動作します。
あるいは、Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats interference(CRISPRi)を使用して、ヒトの癌におけるlncRNAを阻害することができる20。さらに、ゲノムワイドなCRISPRiスクリーニングは、容易にプログラムでき、広範囲のコード遺伝子とノンコーディング遺伝子を標的として、それらの機能的影響を調べることができる21,22。CRISPRiでは、触媒欠損Cas9(dCas9)がKrüppel関連ボックス(KRAB)ドメイン23などの転写抑制ドメインに融合しています。dCas9-KRABによる遺伝子抑制は、ガイドRNA(gRNA)によって目的領域に誘導されます。CRISPRiはDNAレベルで遺伝子を制御し、転写後レベルで活動するRNA干渉とは対照的に、より高い効率と望ましい機能喪失表現型をもたらす24。標的サイレンシングにおけるKRABの有効性が限られていることに対応して、KRABとMeCP2とdCas9との融合がより効果的な抑制戦略として導入されました25。
単一遺伝子サイレンシングはがんの生存率に影響を与える可能性があるが、合成の二重または複数の致死的相互作用は、がん細胞を細胞死から救うことができる26。合成致死性には2つ以上の遺伝子が関与し、それぞれが他の遺伝子の機能を補うことができます。単一遺伝子ノックダウンスクリーニングの問題を克服するために、致死的なタンパク質をコードする遺伝子ペアを標的とするデュアルCRISPR戦略は、有望なアプローチを提供します27。
ここでは、ヒトメラノーマ細胞のKRAB-MeCP2に融合した 黄色ブドウ球菌 および 化膿連鎖 球菌dCas9を使用して、lncRNAまたはその他のノンコーディングRNAペアの直交CRISPRiベースのターゲティングのコンビナトリアル使用のためのプロトコルを示します( 図1を参照)。このプロトコルは、組み合わせ型の古典的CRISPRノックダウンや、がんにおける合成致死ペアのCRISPRiベースのスクリーニングに利用できます。CRISPRiアプローチでは、 SpCas9と SaCas9の2つの異なるdCas9種を使用することで、交差反応性を最小限に抑えながら異なるゲノム遺伝子座を独立して標的化することができ、高いオンターゲット選択性を確保しながら特異性と柔軟性を高めることができます。 SPCas9にはNGG、 SaCas9にはNNGRRTなど、さまざまなプロトスペーサー隣接モチーフ(PAM)が利用されます。デュアルdCas9システムは、単一のタイプのdCas9を使用する場合、正確な同時調節を可能にし、sgRNA-RNP複合体の競合を減らすことで、sgRNAの適合性が限られているなどの課題に対処します。この革新により、デュアルsgRNAライブラリースクリーニングの堅牢性と汎用性が向上します。結論として、私たちは、がんモデルとして黒色腫細胞に完全に機能するデュアルCRISPRiシステムを提供します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
図1:ノンコーディングRNAの合成致死的相互作用を標的とするデュアルCRISPRiシステムのスキーム。 (A)デュアルgRNAベクターのクローニング手順。(B)HEK293細胞にエンベローププラスミドVSV-G、パッケージングプラスミドPAX2、およびトランスファーベクターをトランスフェクションしてレンチウイルスを作製し、その後501-mel細胞に形質導入しました。 SpdCas9-KRAB-MeCP2(青)と SadCas9-KRAB-MeCP2(赤)の遺伝情報を含むレンチウイルスを501-mel細胞に同時に組み込みました。抗生物質の選択に続いて、目的のデュアルgRNA(オリーブグリーン)を統合するために、2回目のレンチウイルス形質導入を行いました。(C)dCas9変異体を発現する501-mel細胞は、対応するgRNAと相互作用して標的遺伝子発現をサイレンシングし、がん細胞死をもたらします。BioRender.com で作成。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

<table><tbody><tr><td>Amicon Ultra Centrifugal Filter, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) マウスモノクローナル抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) モノクローナル抗体</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>抗GAPDHマウスモノクローナル抗体&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>抗マウス IgG (全分子) &ndash;ウサギ</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ブラストシディジン S 塩酸塩</td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 発光細胞生存率アッセイ</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>遠心分離機</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect リアルタイム PCR 解析システム</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubator Model CB 170</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) 制限酵素</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Serological Pipet</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 25 mL セロジカル ピペット</td><td>コーニング</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 5 mL セロロジカル ピペット</td><td>コーニング</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>ウシ胎児血清</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>ギブコ ダルベッコ修正されたイーグル」培地(DMEM)、高グルコース、ピルビン酸</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>Human mel 501-mel</td><td>は、Aifantis Lab(ニューヨーク大学)から提供されました</td><td>RRID:CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK細胞株</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell system&nbsp;</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN テトラ ハンドキャストシステム</td><td>バイオ・ラッド</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction&nbsp;</td><td>ニューイングランドバイオラボ</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>無脂肪粉乳&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS サンプルバッファー (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl Chemically Competent E. coli</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>PCR Tubes 0.5 ml (Flat Cap)VWR</td> <td>International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Saline (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer</td><td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Kit&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>ポリエチレン、分岐</td><td>型 Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>ピューロマイシン二塩酸塩</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Purification Kit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 微量遠心チューブ 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>塩化ナトリウム、5 M Aqua Solution、RNase Free</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>シリンジ フィルター PES 33mm 0.2 &mu;M</td><td>フィッシャー サイエンティフィック</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC ディッシュ 100、スタンダード</td><td>サルスタット</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC プレート 6 ウェル、スタンダード、F</td><td>サルスタット</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>トリス ベース</td><td>ロシュ</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

がん細胞のノンコーディングrna間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルcrispr干渉戦略

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

SadCas9-KRAB-MeCP2およびSpdCas9-KRAB-MeCP2の発現カセットを、等量のレンチウイルスによる形質導入を使用して同時に501-mel細胞に組み込みました。このCRISPRiプロトコールはdCas9-KRAB-MeCP2バリアントの発現に依存しているため、ウェスタンブロット分析はタンパク質レベルでの存在を確認するのに理想的です。陽性トランスフェクション細胞の濃縮後、ウェスタンブロット分析のためにサンプルを採取し、dCas9-KRAB-MeCP2オルソログの存在を確認しました。形質導入が成功すると、SpdCas9-KRAB-MeCP2融合タンパク質(202 kDa)およびSadCas9-KRAB-MeCP2融合タンパク質(170 kDa)に対応する単一バンドが期待され、図2Aに示すように、それぞれのCas9オルソログに特異的な抗体を使用して確認されました。しかし、ウェスタンブロットが不可能な場合は、qPCRを使用してmRNAレベルで融合タンパク質を検証することができます。
機能リプレッサーを安定的に発現する501-mel細胞が作製されたら、デュアルgRNAベクターを用いて2回目のレンチウイルス形質導入を行った。RP11とXLOCは、転移性黒色腫の短期培養でアップレギュレーションされることが以前に示されており、個々のCRISPRiターゲティングは、増殖と細胞生存への影響を実証しました28。したがって、このlncRNAペアを概念実証の合成致死ノンコーディングRNAの組み合わせとして評価するために選択し、改変された細胞における累積的で容易に観察可能な増殖表現型を予想しました。
生存率アッセイを用いてがん細胞におけるデュアルCRISPRiの効果を調べるには、両方の標的lncRNAを効果的に抑制する必要があります。qPCRは、転写産物のレベルを測定することにより、この抑制を確認するのに最も適した方法です。私たちは、RNAレベルを決定し、潜在的に致死的なRP11とXLOCのペアを標的とした場合の細胞生存率を調べることにより、開発されたデュアルCRISPRiプロトコルの機能を評価しました。そのため、RP11とXLOCを標的とする異なるgRNAを導入し、標的RNAのレベルを低下させました。RNAの抑制は、 SadCas9-KRAB-MeCP2または SpdCas9-KRAB-MeCP2のいずれかの標的特異的gRNAを使用して調査し、Rosa26を標的とする対照gRNAと個別に、または組み合わせて試験しました26( 図2Bを参照)。XLOCまたはRP11をそれぞれ標的とするgRNAは、それぞれの標的を効果的に抑制しましたが、XLOCとRP11の両方の同時ノックダウンは、XLOC-sa/RP11-spペアでのみ達成されました。
XLOC-sa/RP11-sp gRNAペアを選択した501-mel細胞株において、XLOCおよびRP11 RNAレベルの両方を首尾よく低減したため、デュアルlncRNA抑制生存率アッセイを実施しました( 図2Cを参照)。5日後、細胞生存率は、標的gRNAを個別に使用した場合、Rosa26コントロールの81%と89%でした。RP11-spとXLOC-saの併用は、RP11-sp単独と比較してさらに有意な低下をもたらし、細胞生存率はRosa26コントロールの59%であった。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
図2:デュアルlncRNA抑制システムの機能 (A)ウェスタンブロット分析を行い、抗Cas9抗体を用いて改変された501-mel細胞のdCas9-KRAB-MeCP2変異体を検出しました。形質導入を伴わない501-melの野生型(WT)細胞をコントロールとして使用した(生ブロットについては、補足図3、補足図4、補足図5、補足図6を参照)。(B)修飾された501-mel細胞へのデュアルgRNAの形質導入後のRosa26コントロール細胞と比較したRP11およびXLOC RNAレベルのqPCRベースの分析。GAPDHはハウスキーピング遺伝子として使用されました。(C)デュアルlncRNA抑制生存率アッセイは±、デュアルgRNAを3つの独立した形質導入で修飾された501-mel細胞に統合した後に実施しました。発光値はRosa26コントロールに正規化しました。生存率はSEM±平均(n = 3)で表されます。対応のないt検定が実施されました。アスタリスク(*)は、p &lt; 0.05 での有意差を示します。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1:プラスミドマップ。 マップは Benchling (https://benchling.com/) を使用して作成されました。プロトコールで利用されたプラスミドは、Addgene #96921および#110824から改変されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図2:補足図2:ウェスタンブロット解析 dCas9-KRAB式。 (A)トランスフェクションの6日後における501-mel細胞におけるSadCas9-KRABの発現。(B)501-mel細胞におけるSadCas9-KRABおよびSpdCas9-KRABの逐次形質導入は、トランスフェクション後3週間でSadCas9-KRAB発現の低下をもたらした。(C)501-mel細胞におけるSadCas9-KRABとSpdCas9-KRABの同時形質導入は、トランスフェクション後3週間でSadCas9-KRABの発現を低下させる結果となった。(D)SadCas9-KRABとSpdCas9-KRABの同時形質導入後にSpdCas9-KRABの発現が観察された。LV. レンチウイルスの使用量 (μL) この <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">ファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図3:ウェスタンブロットSaCas9-KRABの生データ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図4:ウェスタンブロットSpCas9-KRABの生データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図5:GAPDH_SpCas9-KRABの生データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足図6:GAPDH_SaCas9-KRABの生データ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表1:利用されたガイドRNA配列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足表2:利用されたDNA配列。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル1:dual-grna-zeo-gfpのFASTAファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル2:dSpCas9-krab-mecp2のFASTAファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>
補足ファイル3:dSaCas9-krab-mecp2のFASTAファイル。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。</a>

がん細胞のノンコーディングRNA間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルCRISPR干渉戦略

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

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がん細胞のノンコーディングRNA間の合成致死的相互作用を標的とするためのデュアルCRISPR干渉戦略

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