ヒト卵管上皮をシングルセル解析で効率的に抽出する方法

私たちの研究の焦点は、卵巣がんにおける化学療法抵抗性を理解し、これと闘うことです。私たちは、耐性を促進するメカニズムと細胞亜集団、およびこれらの攻撃的な集団を根絶するための新しい標的の発見を目指しています。

単一細胞RNA配列決定は、不均一な卵巣腫瘍における亜集団の特性評価を容易にします。私たちは、卵巣がん分析の正常起源細胞として非癌性卵管上皮細胞を活用しています。

卵管上皮細胞を濃縮した単一細胞懸濁液に効率的に単離することは、高悪性度漿液性卵巣がん疾患の発症をさらに理解するのに役立ちます。この機械的および酵素的消化技術は、生存可能な卵管上皮細胞の濃縮単一細胞懸濁液を抽出するためのより効率的なプロセスを提供します。

[ナレーター]まず、解離培地を含む15または50ミリリットルのチューブに新鮮なヒト卵管を収集し、チューブを氷の上に置きます。卵管を新鮮な解離培地を含む滅菌ペトリ皿に移し、サンプルを解剖顕微鏡下に置きます。次に、細い先端鉗子とヴァンナス・テュービンゲンはさみを使用して、脂肪、結合組織、およびチューブの周囲の血管を解剖します。次に、はさみで卵管の冠状面を切り、直径3〜5ミリメートルの小さな円柱を形成します。切断中に組織を安定させるために、fine=point 鉗子を使用します。組織片を含む皿から解離培地を慎重に吸引します。ティッシュ片を2ミリリットルの冷たい1x PBSで2回洗浄し、プレートを軽く回転させます。PBSを吸引した後、組織片を室温で冷たい5ミリモルEDTAで5分間インキュベートします。組織断片を冷たい1%トリプシンハンクスバランス塩溶液に懸濁し、摂氏4度で40分間インキュベートします。1%トリプシンハンクスバランス塩溶液を吸引し、組織片を低温解離培地で2回洗浄してトリプシンを不活性化します。組織断片を2ミリリットルの解離培地に0.4ミリグラムのDNaseとともに室温で少なくとも30分間インキュベートします。DNase培地に中にあるまま解剖顕微鏡下で、卵管の断片を鉗子で保持し、内腔が皿の底と平行になるようにします。鉗子を使用して組織を繰り返し押さえ、内腔から上皮細胞を排出します。組織の周囲の細胞のハローの放出を確認します。培地を含む細胞を滅菌15ミリリットルチューブに移します。ペトリ皿を解離培地で2回洗浄し、同じチューブ内で洗浄液を混ぜ合わせます。残りの間質チューブの断片を廃棄します。細胞を採取するには、500gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、ペレットを1ミリリットルの解離培地に再懸濁します。次に、10マイクロリットルの細胞懸濁液を同量のトリパンブルーと混合します。10マイクロリットルの混合物をチャンバーカウンティングスライドにピペットで入れ、セルカウンターに挿入して細胞数を測定します。細胞を1型コラゲナーゼとDNaseを含む9ミリリットルの解離培地に再懸濁します。摂氏37度で30〜45分間、200RPMに設定されたオービタルシェーカーでインキュベートします。細胞を採取するには、500gで5分間遠心分離します。上清を吸引した後、ペレットを5ミリリットルの解離培地に再懸濁してコラゲナーゼを洗い流します。細胞懸濁液を100マイクロメートルの細胞ストレーナーを通して50ミリリットルのチューブに通し、濾液を500gで5分間遠心分離します。細胞ペレットが赤く見える場合は、赤血球を溶解するための赤血球溶解バッファーを調製します。ペレットから培地を吸引し、希釈した赤血球溶解バッファー5ミリリットルを加え、サンプルを氷上で3分間インキュベートします。赤血球溶解を止めるには、45ミリリットルの1x PBSをチューブに加えます。チューブを500gで5分間遠心分離します。細胞を採取し、1ミリリットルの解離培地に再懸濁した後、10マイクロリットルの細胞懸濁液を同量のトリパンブルーと混合します。10マイクロリットルの混合物をチャンバーカウンティングスライドにピペットで入れ、セルカウンターに挿入します。フローサイトメトリー分析により、卵管組織から生存可能で濃縮された上皮細胞集団が平均82%の生存率で単離されたことが確認されました。CD45陽性免疫細胞を採取した後、EpCAM陽性上皮細胞はサンプルの平均80%を占め、CD10陽性の間質細胞汚染は7.8%と最小限でした。単離された上皮細胞は、プレーティングの4〜6日後に2D培養で付着した石畳のようなクラスターを形成し、上皮の同一性を確認しました。免疫化学により、ほとんどの培養細胞がEpCAMとPAX8を発現し、ビメンチン陽性細胞はごくわずかであることが明らかになりました。繊毛細胞は培養中に存在しました。