緑膿菌における運動表現型を観察するためのハイスループット法

私たちの研究は、システム生物学とゲノミクスを用いて細菌がどのように働き、感染を引き起こすかを理解することに焦点を当てています。私たちは、感染環境を模倣した状態の細菌生理に影響を与える遺伝子を特定し、より良い抗生物質や代替治療法の開発に向けた新たな標的を見つけることを目指しています。また、緑膿菌の運動性に影響を与える遺伝的要因を特定するハイスループットプロトコルを開発し、群れ行動や痙攣行動のゲノム全体解析を可能にします。この研究は、バイオフィルム形成、定着、宿主防御回避にも寄与する運動性を駆動する分子メカニズムを明らかにしました。

さまざまなアッセイや細菌種に適応可能です。まず、Pseudomonas aeruginosa トランスポゾン変異体ライブラリーのソースプレートを室温の表面に平らに置いて約1時間冷却します。望ましいアッセイでは、群れにはM9グルコース0.5%寒天プレート、ツイッチ用にはLB寒天1%寒天プレートを選択します。

正確なコロニー移動のためにレプリケーターを設定するには、レプリケーターをオンにしてください。選択と操作モードのセクションで、選択して保存プログラムを実行してください。「ソースプレートを選択する」セクションで、プラスプレート384の寒天を選択します。

次に、ターゲットプレートの選択セクションで、プラスプレート384の寒天を選択します。「選択パッド」セクションで、ショートピン384を選択します。シンガープログラムでは「複製する多くのもの」を選択し、複製プログラムのオプションで「一般」「リサイクル」「なし」を選びます。

セクションソースでオフセットを選択し、ランダムおよびデフォルト半径を選択します。セクションターゲットでピンを選び、圧力を2%に調整してください。その他の設定はデフォルトのままにしてください。その後、短いピンのRePads 384を適切なコンパートメントに差し込みます。

ソースプレートとターゲットプレートをレプリケーターの指定プラットフォームに配置してください。384の密度源プレートと空の運動性プレートをプラットフォームに設置します。選択したパラメータを使って実行を押して転送プロセスを開始します。

微生物アレイピンニングロボットは、384密度源プレートからモチリティプレートへコロニーを移します。その後、接種した運動促進プレートをビニール袋に入れます。プレートを入れた袋を慎重にインキュベーターに入れ、37度に設定して18時間入れます。

インキュベーション期間終了後、高品質な画像ソフトウェアを使って運動板の高解像度画像を撮影してください。運動性アッセイと運動性プレートのイメージングを行った後、ImageJでマクロを実行します。画像が入っているフォルダを開き、バッチを読み込み分析します。

指示があれば、プレビューオプションで角度を調整してプレートがまっすぐになるまで調整し、プレートの回転を調整します。満足したらOKボタンをクリックします。次に、長方形ツールをコロニーの周りに動かして、植落を含む部分をトリミングします。

準備ができたら、OKをクリックしてトリミングを完了します。各コロニーの周囲に関心領域(ROI)を描くためのグリッドを定義し、運動面積を測定します。適切な群落密度を選択し、各円が群落の周りに配置されるようにパラメータを調整します。

準備ができたらOKボックスを有効にし、OKボタンをクリックします。各コロニーの運動領域を測定し、そのデータを含むCSVファイルが指定されたフォルダに保存されます。運動性アッセイでは、M9、グルコース、カサミノ酸、硫酸マグネシウムを含む寒天溶液をオートクレーブします。

冷却して混ぜた寒天を25ミリリットルずつペトリプレートに注ぎます。次に、各プレートに2.5マイクロリットルの一晩の細菌培養液を接種し、蓋を上にして37度Cで18時間培養して運動表現型を観察します。LB溶液を1%寒天でオートクレートした後、冷却したLB 1%寒天を25ミリリットルペトリプレートに注ぎます。

1%寒天を含む痙攣プレートの底部に細菌を接種します。プレートは37度で48時間孵化し、その後室温でさらに48時間培養します。孵化後は慎重に寒天をプレートから取り除きます。

ペトリ皿を1%のクリスタルバイオレット溶液で染めて、ピクピクゾーンを視覚化します。痙攣運動率アッセイでは、T4P機構の遺伝子欠失を持つPseudomonas aeruginosa変異株は野生型に比べてハロー領域が有意に小さいことが示され、痙攣運動性が低下していることが示されました。群れ運動解析により、PA14ライブラリの欠失変異体は突出のないハロー領域が有意に減少しており、群れ能力の欠陥が確認されました。

細菌の運動性研究は、しばしばスループットによって制限されます。当社のハイスループット運動プロトコルは、研究者が細菌の運動性を包括的に研究するのに役立ちます。例えば、ゲノム全体変異体コレクションを用いることで、運動性に関連するすべての遺伝子を特定し、細菌がどのように感染を引き起こすかを明らかにすることが可能になります。

本研究結果は、緑膿菌の運動性の遺伝的制御、バイオフィルム形成における役割、病因との関連について新たな疑問を提起しています。また、環境条件が運動性行動にどのように影響するか、運動性遺伝子を標的化することで革新的な抗菌療法が生まれるかどうかの探求にも役立っています。