Name: ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: 学ぼう、PVA・PCLナノファイバー膜を用いた上皮細胞と線維芽細胞の三次元共培養システムの構築方法。この技術は組織工学における細胞間相互作用の研究とより生理的な培養環境の提供に貢献します。

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<meta charset="utf8"></head><body>上皮細胞および線維芽細胞のための高度な2層3D共培養システム

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% トリプシン/EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>LPS solution</td><td>CBP007A</td><td></td></tr><tr><td>4% パラホルムアルデヒド</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 標識 ZO-1 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>抗体希釈剤OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 assay kit</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture dish (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Red CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>円錐管</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>カバーガラス</td><td>コーニング</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 高グルコース</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN デシケーターベース、平面フランジ、ねじ山付き</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURANガラスデシケーター蓋&ストップコック</td><td>ダイハンサイエンス</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURANストップコック PTFEスピンドル付</td><td>DWKライフサイエンス&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>エレクトロスピニングマシン</td><td>ナノNC</td><td>ESR200RD</td><td></td></tr><tr><td>エチルアルコール ピュア</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>459844</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>シグマ アルドリッチ</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>蛍光レーザー共焦点スキャナーモジュール K1-fluo</td><td>ナノスコープシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ゲル/マウント</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>グルタルアルデヒド溶液</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>金属ノズル 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>マニキュア ネイチャー</td><td>リパブリック</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ノーマルヤギ血清</td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>四酸化オスミウム</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>プラスチックSyringe_Lureロック (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>ポリ(アクリル酸)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poly(ビニルアルコール)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Polycaprolactone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>PureHCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>走査型電子顕微鏡</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>スライドガラス</td><td>マリエンフェルド スーペリア</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>シルガード 184 セット</td><td>全知</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>シナジー H1 マルチモード リーダー</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

このプロトコルは、ナノファイバー膜ベースの2層モデルを構築することにより、MLE-12肺上皮細胞とNIH3T3線維芽細胞を共培養するための重要なステップを概説しています(図1)。このモデルは、共培養細胞の生細胞イメージング、免疫組織化学、およびエンドポイント定量分析に適しています。他の細胞型も、細胞密度および増殖条件を最適化することによって利用することができる。
SEMは、ビード形成なしで作製されたPVAナノファイバーの均一な分布を示しています(図2A)。PVAナノファイバーの直径は、150nm〜230nm(180nm±25nm、平均±標準偏差(SD))の範囲でした。エレクトロスピニングPCL NM中のナノファイバーはランダムに配向しており、構造的にはコラーゲンに類似していました(図2B)。PCL NMのほとんどのファイバーの直径は300 nm〜7 μm(3.8 μ ± 2.5 μm)でした。したがって、PVAナノファイバーメンブレンは、PCLナノファイバーメンブレンよりも細孔サイズが小さかった。
播種前に、MLE-12細胞とNIH3T3細胞をそれぞれ赤と緑で染色し、共培養プロセス全体を通してモニターしました。 図3に示すように、インサートチャンバー内のMLE-12細胞と下部チャンバー内のNIH3T3細胞の空間分布がはっきりと観察できました。フォーカススタッキング解析により、NIH3T3細胞はさまざまな深さ(102±20μm)に分散して検出され、MLE-12細胞は80±10μmの厚さの層を形成したことが明らかになりました。NIH3T3細胞はPCLナノファイバー膜に浸潤してナノファイバー軸に沿って伸び、MLE-12細胞はPVAナノファイバー膜の表面に付着して凝集を示しました(図4)。次に、NIH3T3細胞とMLE-12細胞の細胞骨格組織をアクチン染色により調べました。PCLナノファイバーメンブレン上で培養したNIH3T3細胞は、組織中の細胞に似たアクチンフィラメントの飛翔体分布を示し、PVAナノファイバーメンブレン上で培養したMLE-12細胞のアクチン染色は、細胞の広がりのない丸い凝集体を示します(図5)。
単一培養と共培養におけるMLE-12細胞の分布と増殖パターンを比較しました。PVA NM上での単一培養でCell-Trackerの赤色染色細胞は凝集体を形成しましたが、共培養条件の細胞はメンブレン上に均一な分布を維持していました(図6A)。共焦点顕微鏡画像の3D解析では、PVA NM上の共培養MLE-12細胞の成長パターンは、線維芽細胞の非存在下で培養された細胞と比較して、よりコンフルエントな細胞密度で培養細胞の膜への層状接着を示しています(図6B)。さらに、細胞間接着および細胞表面上の帯状オクルージン(ZO)-1の発現(矢印が示されている)が、細胞凝集体では発現していないことが、線維芽細胞を含まない培養よりも共培養条件でより明白でした(図6C)。
膜上の細胞の増殖は、CCK-8アッセイを使用して測定しました。NIH3T3およびMLE-12細胞の増殖は時間とともに増加しました(図7)。しかし、細胞の増殖速度は、培養プレート上よりも膜上で観察されました(データは示していません)。NM上で共培養したNIH3T3およびMLE-12細胞は、培養プレート中の単一培養細胞と比較して安定した増殖速度を示します。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
図1:スキャフォールドベースの2層システムでのNIH3T3線維芽細胞とMLE-12上皮細胞の共培養法を示す模式図。 略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
図2:PVAおよびPCLナノファイバーの構造 (A)PVAおよび(B)PCLナノファイバー膜は、エレクトロスピニングにより作製した。ナノファイバーの構造と直径は、膜表面のSEMによって測定されます。スケールバー = 1 μm (A)、10 μm (B)。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
図3:共培養システムにおいて、PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞とPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞の空間分布。NIH3T3細胞(4 × 105)をCell-Tracker Greenで、MLE-12細胞(3 × 105)をCell-Tracker Redで染色しました。播種した細胞を24時間培養し、共焦点顕微鏡のZスタッキング画像を用いて観察しました。数値はμmで示されます。矢印は、X(幅)、Y(長さ)、Z(奥行き)の寸法を示します。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
図4:PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞およびPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞の接着と形態。 細胞をメンブレン上で24時間培養し、SEMを用いて2,000倍の倍率で観察しました。スケールバー = 15 μm。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン)。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
図5:PCLナノファイバー膜上のNIH3T3細胞およびPVAナノファイバー膜上のMLE-12細胞におけるアクチンストレスファイバー。 NIH3T3細胞(4×105)およびMLE-12細胞(3 × 105 細胞)をそれぞれPCLおよびPVAナノファイバー膜上に播種した。48時間培養後、細胞をファロイジン-iFlour 488で染色し、共焦点顕微鏡を用いて観察しました。スケールバー = 50 μm。略語:PVA =ポリビニルアルコール;PCL =ポリ(ε-カプロラクトン);FITC = フルオレセインイソチオシアネート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
図6:PVAナノファイバー膜上での共培養MLE-12細胞の増殖パターン。 (A)Cell-Trackerの赤色染色MLE-12細胞(3×105 細胞)をPVAナノファイバー膜上に播種し、単独(-NIH3T3細胞)およびNIH3T3細胞を2層システム(+NIH3T3細胞)で48時間培養した(B)単一培養および共培養MLE-12細胞をHoechst 33342(青)およびPhalloidin-iFlour 488で染色し、共焦点顕微鏡で観察した。3D画像は、Imarisソフトウェアの表面機能を使用して表示されます。(C)MLE-12細胞を48時間培養し、Phalloidin-iFlour 488および抗ZO-1抗体(赤)で蛍光標識した。スケールバー = 50 μm。略語:PVA=ポリビニルアルコール。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
図7:2層共培養システムにおける細胞の増殖速度。 NIH3T3細胞(4×10、5)およびMLE-12細胞(3×10、5)を指定の時間共培養します。インサートウェルおよびボトムウェル内の細胞増殖は、CCK-8アッセイを用いて測定されます。データは平均± SD(n = 3)で表されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Bioengineering

バイオエンジニアリング（生体工学）

簡単な方法は、関連付けられている上皮細胞上の組織線維芽細胞に及ぼす影響を分析するために記述されています。このメソッドは、三次元組織培養の組み合わせにより、3Dから分離後の細胞の分析を容易にすることができます。技術は、腫瘍細胞上の腫瘍関連間質の効果の系統的な研究を可能にする、悪性度を変化させるセルに適用されます。...

三次元混合細胞スフェロイド共培養から乳腺上皮細胞の分離

生体材料技術の進歩により、3次元のマルチセルタイプのコンストラクトの開発が可能になりました。私たちは、気道の主要な構造細胞を培養するための3つの個別の足場を作製するエレクトロスピニングプロトコルを開発しました...

三層のための3つのユニークな環境を提供するために、エレクトロスピニング法を適応させます<em&gt;インビトロ</em&gt;気道壁のモデル

この原稿は、細胞外マトリックスに囲まれた定義された幾何学的形状の3次元（3D）上皮組織の均一な配​​列を操作するソフトリソグラフィーベースの技術が記載されています。この方法は、細胞の種類および実験の文脈の多種多様に適していると同一の​​複製のハイスループットスクリーニングを可能にします。...

細胞外マトリックス内に埋め込まれたエンジニアリング三次元上皮組織

現在の二層文化モデルは模倣する生体内微小機能の in vitro研究できないようにします。ポリエチレング リコール、酸化亜鉛テンプレート...

デュアルのバイオミメティック基底膜として極薄 Porated 弾性ゲルの細胞培養

ここでは、自己組織化ペプチドのひと関節軟骨細胞の脱分化型軟骨への分化を促進する足場の 3 D 培養システムを取得するためのプロトコルを提案する.

三次元ペプチド足場で哺乳動物の細胞を培養

このプロトコルは、ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞の単離を記述し、臨床および生理学的病理学モデルにおける可能な適用のための異質性および機能的特性を決定する。...

ヒト羊膜の異なる解剖学的領域からの上皮細胞のインビトロ培養

提示されたプロトコルは、マイクロ流体動的培養チャネルおよび従来の固定ウェル静的培養チャンバーにおける接着細胞層構造を視覚化するための共焦点レーザー走査型顕微鏡(CLSM)を用いたファロイジンベースの糸状アクチン染色技術の開発と使用について説明しています。このアプローチは、細胞層のコンフルエント性、単層形成、および層厚の均一性を評価するのに役立ちます。...

生理的サイズのマイクロ流体培養装置における上皮細胞単層の作製と構造評価

プラスチックメンブレンを使用した組織培養インサートは、細胞層やバリア組織のモデルを確立するための透過性サポートとして、細胞培養ラボのゴールデンスタンダードです。ここでは、プラスチックメンブレンを、組換え官能基化されたクモの糸タンパク質から作られた、より生物学的に関連性のあるメンブレンに置き換える簡単な方法を紹介します。...

ナノフィブリル基底膜模倣品 カスタムメイドの組織培養インサートに組換え官能基性クモの糸で作られました

ポリジメチルシロキサン(PDMS)チップデバイスの膜用防水シリコーン系シールを製造するための新しいシーリングプロトコル。ラボでのチップモデルの構築や小規模なチッププラットフォーム開発を目的としています。このプロトコルはプラスチックとネイティブ組織膜を用いて実証します。この手順にはPDMS、トルエン、型、膜、真空チャンバーのみが必要です。...

柔軟で信頼性の高い接着のためのシリコーンチップ・トゥ・膜シールのアクセスしやすい手順

光学分解能光音響顕微鏡（OR -...

三次元光学分解能光音響顕微鏡

学ぼう、PVA・PCLナノファイバー膜を用いた上皮細胞と線維芽細胞の三次元共培養システムの構築方法。この技術は組織工学における細胞間相互作用の研究とより生理的な培養環境の提供に貢献します。

ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

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