ナノファイバー膜を用いた上皮細胞の三次元共培養モジュールの確立

私たちの研究グループでは、ポリビニルアルコール、PVA、ポリイプシロン-カプロラクトン、PCL、ナノファイバー膜を用いて、3次元共培養システムを開発しています。これは、膜が上皮細胞と線維芽細胞をどのように支え、組織環境を模倣し、パターニングシグナル伝達と細胞相互作用の研究を促進するかを明らかにすることを目的としています。多孔質電気紡糸ナノ繊維膜が上皮細胞を形成させ、多層化を可能にし、線維芽細胞が追加のマトリックスごとに成長することを示します。

この手法は、拡張された3Dシステムが、従来の2D培養と比較して、成長する組織により良い環境を提供できることを強調しています。分化した上皮細胞を用いた共培養システムを提供しています。幹細胞を用いた組織化には複雑な分化手順が必要ですが、私たちのモデルには、3D共培養システムの開発における簡便性と時間の節約という利点があります。

私たちは、共培養でナノファイバー膜とオーバーレイヤーハイドロゲルを組み合わせることにより、ナノファイバースキャフォールドの限界を克服することに焦点を当てています。まず、0.02グラムのポリアクリル酸と1グラムのPVAを、磁気バーが入ったきれいなガラス瓶に加えます。ボトルに7.8ミリリットルの蒸留水を加え、ボトルをプレートスターラーに置きます。

ボトルが室温に冷えたら、0.2ミリリットルのグルタルアルデヒドを加え、室温で30分間、500RPMのプレートスターラーに戻します。エレクトロスピニングには5ミリリットルのシリンジを使用してください。プランジャーをバレルから分離し、バレルとプランジャーの先端の内側にある小さなプラスチックの破片を清掃します。

次に、針を使用して液体の流れを遮断し、PVA溶液を各シリンジに注ぎます。プランジャーをバレルに組み立て、針を取り外します。新しい27ゲージの金属針を組み立てた後、電気紡績機に入れます。

コレクターをアルミホイルでしっかりと包みます。インジェクターパネルが元の位置に戻ったら、エレクトロスピニングマシンを注入量2ミリリットル、注入速度6マイクロリットル/分、ローラー速度100 RPM、先端からコレクターまでの距離を14センチメートルに設定します。各ポンプの液体の流れを確認してから、約12キロボルトの電位で電気紡糸機を運転します。

エレクトロスピニングプロセスが完了したら、ファイバーマットを含むホイルをコレクターから取り外します。ナノファイバーマットを乾燥剤に入れて真空下で保管します。きれいなガラス瓶に1.5グラムのPCLと8.5ミリリットルのクロロホルムを加えます。

ボトルをプレートスターラーに置き、PCLをクロロホルムに室温で12時間溶解します。ナノファイバーメンブレンの小片をカットし、自動スパッタ法で薄い金の層で5分間コーティングします。まず、作製したPVAナノファイバーマットをトランズウェルインサートに必要なサイズの小片にカットします。

1.5ミリリットルの純粋な塩酸が入った小皿を準備します。塩酸とナノファイバー片を入れた皿を真空チャンバーに入れ、蓋を閉めます。次に、真空ポンプに接続されたバルブを開き、塩酸の煙が上昇するまで10秒間待ちます。

バルブを閉じ、メンブレンを塩酸フュームで2分間処理します。塩酸処理後、蒸留水を膜に一滴加えます。メンブレンをスライドガラスの上に置き、ホイルから取り除きます。

オートスパッタコーターを使用して、カーボンテープの膜を金の薄い層でコーティングします。次に、塩酸と架橋したPVAナノメンブレンをPBSで3回洗浄し、培地に浸します。浸漬後、pHをチェックして、残留塩酸がないことを確認します。

まず、ナノファイバーマットをPVAナノメンブレンの場合は直径10ミリメートル、PCLナノメンブレンの場合は直径13ミリメートルの丸く切断します。SYLGARD 184ベースと硬化剤をプラスチックカップに10対1の質量比で混合します。きれいなスライドガラスを使用して、ポリジメチルシロキサンまたはPDMS溶液を泡が形成されるまで2〜3分間激しく混合します。

PDMSをスライドガラス上に均等に広げます。チップの下端をPDMSに少しだけ浸します。次に、PDMSが固まるまで、インサートを逆さまにしてスライドウォーマーに10〜15分間置きます。

200マイクロリットルのピペットチップでPDMSをチェックし、粘着性がないことを確認します。次に、インサートの底がメンブレンのナノファイバー側によく向くように、インサートをPVAナノメンブレンピースにしっかりと押し込みます。井戸の中央に蒸留水を一滴加え、鉗子を使用してホイルを慎重に取り除きます。

次に、インサートを新しい24ウェルプレートにしっかりと置き、メンブレンを乾燥させます。ナノメンブレンピースを取り付けるときは、200マイクロリットルのピペットチップをPDMS混合物に浸し、ウェルの四隅と中央に正確に点在させます。プレートをスライドウォーマーに置き、PDMSが5〜7分間硬化するのを待ちます。

次に、PCLナノメンブレンピースをPDMSにナノファイバー側を取り付けた状態で、PDMS含有ウェルに入れます。小さな清潔なブラシを使用して、メンブレンのホイル側をわずかに押して、完全に取り付けます。次に、0.2ミリリットルの70%エタノールをウェルに加えて、ホイルの除去を容易にします。

インサートとトランズウェルセットアップの底を紫外線の下で一晩滅菌します。翌日、インサートに200マイクロリットルのPBSを、ボトムウェルに500マイクロリットルをそれぞれ10分間の3サイクルで追加して、インサートとボトムウェルを洗浄します。細胞が70〜80%の密度に達したら、10ミリリットルのPBSで洗い、2ミリリットルの0.05%トリプシンEDTAを加えてトリプシン化します。

皿を軽くたたいて、細胞を底から取り除きます。8ミリリットルの完全培地を加えてトリプシン酵素を中和し、細胞懸濁液を50ミリリットルの遠心チューブに移します。チューブを400Gで5分間遠心分離します。

上腹部を廃棄した後、細胞ペレットをF12培地を含む5ミリリットルの完全なDMEMに再懸濁します。次に、底のウェルに500マイクロリットルの完全なDMEMF12メディアを充填します。PVAナノファイバー膜に付着したインサートをトランズウェルに移し、50マイクロリットルのMLE-12細胞懸濁液を添加する。

次に、底ウェルに付着したPCLナノファイバーメンブレンに500μLのNIH3T3細胞懸濁液を充填します。細胞を2時間インキュベートした後、トランスウェルセットアップでMLE-12細胞含有インサートとNIH3T3細胞含有ボトムウェルを組み立てると、共培養システム内のNIH3T3細胞とMLE-12細胞の空間分布は明確に区別でき、緑色のNIH3T3細胞はさまざまな深さに分散し、赤色のMLE-12細胞は層を形成していました。NIH3T3細胞はPCLナノファイバー膜に浸潤してナノファイバー軸に沿って伸び、MLE-12細胞はPDAナノファイバー膜の表面に付着して凝集を示します。