Name: 原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: 学ぶ原子間力顕微鏡を用いたマウス肺基底膜のヤング率測定法。凍結切片と力学解析により、がん細胞浸潤抵抗性と組織硬さの関係を解明し、疾患診断と治療指針に貢献する。

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<table><tbody><tr><td>1 mL シリンジ</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>10 mL シリンジ</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>スクリューキャップチューブ</td></tr><tr><td>カンチレバー - MLCT</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>3444</td><td>ピラミッド型先端形状の AFM カンチレバー</td></tr><tr><td>クライオトームブレード</td><td>Leica Biosystems</td><td>14035843496</td><td>ロープロファイルの使い捨てブレード DB80LX</td></tr><tr><td>クライオトームサンプルホルダー</td><td>ライカバイオシステムズ</td><td>14047740044</td><td>試料ディスク 30</td></tr><tr><td>Cyotome</td><td>ライカバイオシステム</td><td>CM1950</td><td>ライカクライオスタット</td></tr><tr><td>ダイレクトオーバーレイエクステンション</td><td>JPK SPMソフトウェア用のブルカーソフトウェア拡張で、倒立顕微鏡の光学画像をSPMソフトウェアのデータビューアにインポートすることができます。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>使い捨てベースモールド</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>両面テープ</td><td>テサフィルム</td><td>56661-00002</td><td>フォトフィルムテープ</td></tr><tr><td>固定スプリングカンチレバーホルダー</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>倒立顕微鏡 - ライカDMi8</td><td>ライカマイクロシステム</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ズ JPK 電動ステージ</td><td>ブルカー</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 CMOS Microscope Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>Version R2024a or higher</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 画像処理ツールボックス</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - 信号処理ツールボックス&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Statistics and Machine Learning Toolbox</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>顕微鏡スライド</td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>カンチレバーキャリブレーション用プレーン顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>- つや消しエッジ</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>クライオセクショニング用つや消しエッジ付き顕微鏡スライド</td></tr><tr><td>ニードル&オスラッシュ;0.9 mm &times;25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT注射&nbsp; 肺サンプル</td></tr><tr><td>への注射針とオスラッシュ;0.9 mm &times;70 mm</td><td>B ブラウン</td><td>4665791</td><td>AFM</td></tr><tr><td>OCT 化合物</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. 化合物</td></tr><tr><td>リン酸緩衝生理食塩水</td><td>Bio&</td><td>Ca2+、Mg2+、500 mL</td>QI Advanced Imaging Extension Bruker <td></td> Software Extension を含まない BS.L1825 PBS solution</tr> を販売します <tr><td></td><td>JPK SPM ソフトウェア用の拡張は、記録された各画像ピクセルに対して、基礎となる力曲線全体を提供します。</td><td></td><td></td></tr><tr><td>メス</td><td>B ブラウン</td><td>5518083</td><td>外科用使い捨てメス</td></tr><tr><td>はさみ</td><td>Kaut-Bullinger</td><td>M681700</td><td>精密はさみ 13 cm&nbsp;</td></tr><tr><td>片面テープ</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>クリスタルクリアテープ、33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>スライドボックス</td><td>GWL 収納システム</td><td>K50W</td><td>スライドボックス 50 スライド用</td></tr><tr><td>実体顕微鏡 - Stemi DR1663</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tweezers - Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

原子間力顕微鏡から得られたフォースマップからのネイティブマウス肺基底膜のヤング率の抽出

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

無傷の肺胞壁の同定と測定の後、このプロトコルの主な結果は、BMのフィルタリングされたヤング率の値です。すべての組織切片でAFM測定に適した歯槽壁を見つけることは不可能であることに注意することが重要です。私たちの実験的観察では、マウスの肺標本に由来する凍結切片の約75%が定量化可能な肺胞壁を示しました。肺BMにおけるヤング率の空間分布を正確に決定するために、3 μm x 3 μmまたは4 μm x 4 μmのいずれかにまたがる力マップを使用することをお勧めします。このアプローチにより、通常100 nm〜200 nmの厚さを測定するマウス肺BMを検査するのに十分な解像度が確保されます。したがって、実験的なアプローチでは、各フォースマップの 50 x 50 のフォースカーブをキャプチャし、合計 2,500 のフォースカーブを生成します。フォースマップ内では、フォースカーブは等間隔で配置されています。これは、BMのヤング率に加えて、BMを取り巻く組織構造が小さな力マップでもプローブされることを意味します。したがって、肺BMのみのヤング率を正確かつ選択的に決定するために、このプロトコルに2段階のフィルタリングプロセスを実装しました。
オペレーター依存の空間フィルタリングの最初のフィルタリングステップでは、分析されたフォースマップに含まれる合計結果値の約10%から25%を含む、マウスの肺BMに由来するフォースカーブフィット結果が選択されます。この最初の空間フィルタリングの後、約 250 から 625 の近似結果がさらに分析のために保持されます。次のフィルタリング手順では、修正されたヘルツモデルによって適切に記述された力曲線から生じるBM関連の結果のみが含まれるようにします。したがって、修正されたヘルツ モデル フィットの決定係数 (R2) がフィルター基準として使用されます。私たちの経験的経験は、R2 値が 0.96 より大きい結果を保持することが、このプロトコルを順守することによって得られる適合結果に適していることを示唆しています。R2 値は、力曲線のベースラインの品質 (滑らかさ) と長さ、接触点の決定、および近似モデルの収束に大きく影響されることに注意することが重要です。両方のフィルタリング手順を適用した後、約100〜500のヤング率の値が通常、単一の肺胞壁のBMに残ります。
BMからのこれらの残りのヤング率値の分布は、ヒストグラムを使用して視覚化できます(図4A)。結果として得られる肺BMのヤング率の値は、正の値61しか達成できない確率変数で一般的に観察される対数正規分布に従うことに注意することが重要です。これは、 図4BのQQプロットで視覚化されています。したがって、正規分布 (ガウス分布) を対数変換されたヤング率 (E) 値の分布に適合させることができます。ここでは、自然対数 (ln) を使用して E 値を変換しました。分布のピーク位置 (μ) と標準偏差 (σ) をこの近似から抽出し、その後再変換して、次の式を使用して EBM で示される代表的なヤング率を求めました。
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
再変換後、標準偏差区間はピーク値を中心に対称ではなくなることに注意してください。標準偏差区間の負のエッジ(σ-)と正のエッジ(σ+)は、次の式を使用して計算できます。
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
これらの方程式は、指数関数が自然対数62の逆関数であるという事実の結果です。
図 4A のヒストグラムから求められたピーク値 (μ = 9.31) と標準偏差 σ = 0.18 を再変換すると、代表的なヤング率の値は EBM = 11.05 kPa で、標準偏差間隔は [-1.82 kPa, +2.18 kPa] となります。あるいは、対数正規分布を変換されていないヤング率(E)値のヒストグラムに当てはめて、分布の特性パラメータを決定することもできます。
マウスごとに少なくとも4つの壁を分析して、Hartmannら59で詳細に示したように、頑健な代表的な結果を得ることが推奨される。マウスの代表的なヤング率 EBM を決定するために、4つの壁すべての対数変換値を1つの結合ヒストグラムにプロットし、正規分布を適合させることによってμとσを決定しました。続いて、μおよびσを前述のように再変換して、 EBM および対象マウスの標準偏差間隔を取得する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
図1:マウス肺基底膜のヤング率を決定するための主なプロトコルステップの概要。 最初のステップでは、マウスの肺を入手して準備し、その後にマウスの肺を埋め込みます。したがって、OCT培地とPBSの組み合わせで肺を注入し、次にOCT化合物に完全に浸します。その後、クライオトームによる凍結切片により、厚さ15μmの肺組織切片が得られます。このプロトコルでは、切断プロセス中にサンプルを所定の位置に固定するために片面および両面の粘着テープを使用するプロセスについて詳しく説明します。その後、BMのヤング率の値は、組織切片のAFMフォースマップ測定によって決定されます。力曲線解析プロセスの完了後、空間フィルタリングとR²フィルタリングを適用して、対象構造、特にBM(力マップでは緑色で示され、対数変換されたヤング率分布で定量化)のヤング率の結果が分離されます。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
図2:マウスの肺組織切片で行われた例示的なフォースマップAFM実験(A)マウスの肺組織切片の明視野顕微鏡概観画像で、2つの肺胞の間に位置する適切な無傷の肺胞壁の同定を可能にした。画像の右側には、AFMの三角形のMLCTカンチレバーFが見えます。(b)組織切片内の選択された壁の拡大図。(C)歯槽壁の50 x 50の力曲線を含む概観15 x 15 μmマップの傾斜および(D)高さチャネル。スロープ チャネルでは、BM は明るい線 (白い矢印) として識別でき、壁内の剛性が増加した構造を示しています。高さのチャネルは壁の完全性を確認し、破裂の証拠を示していません。概要の15 x 15 μmマップでBMを特定した後、50 x 50の力曲線を持つ小さな4 x 4 μmマップ(E:スロープチャネル、F:高さチャネル)が記録されます。スケールバー:(A)200μm、(B-D)25μm。示されているAFM像の色スケールの範囲は、(C)2.36 - 9.29 nN/μm、(D)0 - 3.38 μm、(E)2.36 - 9.29 nN/μm(オーバービュー画像)、2.42 - 8.37 nN/μm(小さい画像)、(F)0 - 3.38 μm(オーバービュー画像)、0 - 1.99 μm(小さい画像)で、暗いものから明るいものまであります。すべてのAFM画像には線形カラースケールが使用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
図 3: 空間フィルタリング手順の視覚化。 (A) 力曲線解析の結果として得られたヤング率マップは、結果の空間フィルタリングを有効にするために結果フィルタリングツールで示されています。BMは、より柔らかい組織コンパートメントに囲まれた明るい(ヤング率の値が高い)ストライプとして識別できます。(B)フィルタリングされていないマップ(A)に対応するヤング率値のヒストグラム。(C) 空間フィルター マスク (緑色の領域) を適用した後、(D) ヒストグラムは、BM として識別された緑色で強調表示された領域からのヤング率の値のみで構成されます。ヒストグラムの左側で観察できる残留ソフト値は、収束不良の近似に起因する可能性があり、これは後続の R² フィルタリング ステップで除去されることに注意してください。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
図4:このプロトコルに従って受け取ったマウス肺BMのヤング率分布(A)結果として得られるBMヤング率の値(N = 325)の対数正規化ヒストグラム。正規分布(黒の実線)を当てはめると、標準偏差がσ = 0.18の平均値μ = 9.31が決定されます。再変換後、これは EBM = 11.05 kPa の BM のヤング率に対応し、非対称標準偏差間隔は [-1.82 kPa, +2.18 kPa] になります。(B)対数化されたBMヤング率の値の分位数と標準正規分布の分位数のQQプロット。このプロットは、分布の左右の裾の一部の値を除き、結果として得られるヤング率の値は主に対数正規分布であることを示しています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>

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